- •1. Взаимодействие фотонов оптического излучения с молекулами. Квантово-механические основы и последствия.
- •1.1. Основные характеристики оптического излучения
- •1.2. Основные квантово-механические механизмы взаимодействия оптического излучения с атомами и молекулами
- •1.3. Электронные переходы в атомах и молекулах при поглощении квантов оптического излучения.
- •2. Законы поглощения света веществом. Спектрофотометрический анализ. Особенности спектрофотометрии биологических объектов. Некоторые специальные методы спектрофотометрического анализа.
- •2.1. Количественное описание поглощения света растворами. Закон Бугера-Ламберта-Бера.
- •2.2. Условия выполнения закона Бугера-Ламберта-Бера.
- •2.3. Качественный и количественный спектрофотометрический анализ.
- •2.3.1. Качественный спектрофотометрический анализ.
- •2.3.2. Количественный спектрофотометрический анализ.
- •2.4. Некоторые специальные методы спектрофотометрии
- •2.5. Особенности спектрофотометрии биологических объектов
- •Оптические неоднородности
- •3. Вторичное излучение света молекулами объекта. Люминесцентный анализ и особенности его использования для исследования биологических объектов.
- •3.1. Явление фотолюминесценции
- •3.2. Электронные переходы в возбужденной молекуле. Законы люминесценции.
- •3.3. Зависимость интенсивности фотолюминесценции от концентрации люминесцирующих молекул. Люминесцентный анализ.
- •3.4. Методы регистрации фотолюминесценции. Спектрофлуориметры. Особенности флуориметрии биологических объектов.
- •3.5. Время жизни возбужденного состояния молекул. Связь между временем жизни возбужденных состояний и квантовым выходом фотолюминесценции.
- •3.6. Влияние окружения люминесцирующих молекул на параметры фотолюминесценции. Флуоресцентные зонды и метки.
- •3.7. Причины снижения интенсивности фотолюминесценции в биологических объектах. Тушение фотолюминесценции. Миграция энергии электронного возбуждения.
- •3.8. Поляризация фотолюминесценции.
- •3.9. Замедленная флуоресценция и фосфоресценция.
- •3.10. Хемилюминесценция биологических систем. Хемилюминесцентный анализ.
- •3.11. Проточная цитофлуориметрия.
- •3.12. Влияние размера люминесцирующей полупроводниковой частицы на ее свойства как люминофора. Квантовые точки.
- •В обычных полупроводниках радиус экситона Бора (ах) определяет размер областей электронного возбуждения.
- •Применение квантовых точек в качестве флуорофоров в медицине и биологии
- •Молекулярные сенсоры
- •Молекулярная диагностика
- •Гибридные молекулярные устройства
- •4.Биофизические основы некоторых фотобиологических процессов. Применение оптического излучения в медицине.
- •4.1. Общие закономерности фотохимических процессов в биомолекулах.
- •4.1.1. Кинетика однофотонных необратимых фотохимических реакций
- •4.1.2. Кинетика однофотонных обратимых фотохимических реакций
- •4.1.2. Кинетика многофотонных фотохимических реакций
- •4.2. Спектры действия фотопревращений молекул и фотобиологических процессов.
- •4.2.1 Спектры действия фотобиологических эффект при небольшой постоянной дозе облучения
- •4.2.2.Спектры действия при постоянной величине фотобиологического эффекта.
- •4.2.3.Спектры действия биологических ответов, зависящих от скорости фотопревращения активных молекул.
- •4.3. Фотомодификация олигомерных и однокомпонентных белков под действием ультрафиолетового излучения.
- •4.3.1. Естественное (солнечное) ультрафиолетовое излучение.
- •4.3.2. Кинетика фотоинактивации белковых молекул.
- •4.3.3. Природа первичных продуктов фотолиза аминокислот и их остатков в белках.
- •Значения для
- •4.4. Действие ультрафиолетового излучения на биологические мембраны.
- •4.5. Действие ультрафиолетового излучения на нуклеиновые кислоты.
3.3. Зависимость интенсивности фотолюминесценции от концентрации люминесцирующих молекул. Люминесцентный анализ.
Как и спектрофотометрия, люминесцентный анализ решает качественную и количественную задачи.
Качественная задача решается на основании сопоставления спектров фотолюминесценции исследуемого образца с аналогичными спектрами выявляемого вещества в чистом виде. Следует заметить, что это сопоставление не всегда бывает просто реализовать, поскольку спектры фотолюминесценции в сравнении со спектрами поглощения при изменении окружения люминесцирующих молекул меняются гораздо сильнее. Поэтому не всегда спектр фотолюминесценции вещества в чистом виде совпадает с таковым в сложном объекте. Качественные критерии сопоставления спектров те же, что и при решении качественной задачи спектрофотометрическими методами.
Количественная задача на основании того факта, что интенсивность фотолюминесценции зависит от концентрации люминесцирующих молекул в образце. Выведем уравнение, описывающее эту зависимость.
По определению, квантовый выход фотолюминесценции есть:
(53)
q=(Число квантов фотолюминесценции)/(Число поглощенных квантов)
Число квантов фотолюминесценции, испускаемых с единицы поверхности образца за единицу времени есть интенсивность фотолюминесценции (Jфл). Если же на поверхность объекта падает возбуждающее монохроматическое излучение с интенсивностью J0, а выходит из него непоглощенное излучение с интенсивностью J, то количество поглощаемых в полосе объекта толщиной l и с единичной площадью поверхности за единицу времени квантов составит J0 – J. Подставим эти величины в выражение (53).
(54)
Исходя из уравнения (54) выразим Jфл в явном виде:
(55)
Кванты фотолюминесценции излучаются образцом во все стороны. Поэтому технически невозможно добиться того, чтобы все кванты фотолюминесценции регистрировались. Соответственно, в выражение (55) следует ввести поправку, которая показывает, какая часть всей флуоресценции образца регистрируется на данном приборе в данное время. Обозначим этот поправочный коэффициент k. Он носит название константа чувствительности прибора. После введения k в выражение (55), получим окончательный вид зависимости Jфл от концентрации (с) люминесцирующего вещества в образце:
(56)
Как видно из уравнения (56), зависимость Jфл=f(c) нелинейна. Однако, при небольших концентрациях исследуемого вещества, когда его оптическая плотность D0,1, выражение (1-10-D) можно разложить в ряд Тейлора по степеням D, ограничившись 2-мя первыми членами:
Отсюда при D0,1:
(57)
Таким образом, если концентрация люминесцирующего вещества в образце невелика, а его оптическая плотность D0,1, зависимость между интенсивностью фотолюминесценции и концентрацией выявляемого соединения можно считать линейной. На практике, однако, не всегда бывает известна D люминесцирующего вещества в исследуемом объекте. Поэтому чаще всего для определения концентрации люминофора приходится в отдельном эксперименте строить зависимость Jфл=f(c) для данного соединения в чистом виде, в интервале концентраций, примерно соответствующих содержанию этого вещества в образце. Эта зависимость затем используется в качестве калибровочной. Следует, впрочем, заметить, что квантовый выход фотолюминесценции у люминофора в чистом виде и в составе сложного многокомпонентного образца не всегда одинаков.
Обратим также внимание на то, что в качестве коэффициента пропорциональности между Jфл и J0 в выражении (56) выступает произведение kq(1-T). В этом произведении все три составляющих, k, q и (1-T), являются величинами меньше единицы. Поэтому Jфл всегда значительно меньше, чем J0. Для регистрации Jфл требуются высокоинтенсивные источники возбуждающего излучения и высокочувствительные фотодетекторы. Поскольку регистрация слабых световых сигналов, таких, как фотолюминесценция, требует специального приборного обеспечения, остановимся подробнее на методах регистрации фотолюминесценции и приборах, позволяющих ее осуществить, подробнее.