3.7. Причины снижения интенсивности фотолюминесценции в биологических объектах. Тушение фотолюминесценции. Миграция энергии электронного возбуждения.

Как уже указывалось выше, в биологических объектах интенсивность фотолюминесценции различных люминофоров часто оказывается значительно слабее, чем у этих же люминофоров в той же концентрации в чистом виде. Помимо рассмотренных явлений экранировки возбуждающего света, реабсорбции фотолюминесценции и светорассеивания, обычных в биологических объектах, дополнительное ослабление вторичного свечения бывает связано с присутствием в этих объектах тушителей фотолюминесценции. Тушителем фотолюминесценции называются соединения, молекулы которых способны эффективно перехватывать энергию электронного возбуждения у возбужденных молекул-люминофоров. При этом формируются возбужденные молекулы вещества-тушителя, которые, однако, инактивируются преимущественно безизлучательно. В результате реальный квантовый выход фотолюминесценции изучаемого люминофора оказывается сниженным, и интенсивность его вторичного свечения падает.

Для количественного описания влияния тушителей напишем схему квантово-молекулярных событий, сопровождающих высвечивание кванта фотолюминесценции (Q – молекула тушителя):

Событие	Электронный переход	Скорость протекания
Поглощение кванта	S0+hпS1	v0=k0J0[S0]
Фотолюминесценция	S1 S0+ hл	v1=k1[S1]
Внутримолекулярное тушение	S1S0	v2=k2[S1]
Тушение молекулой тушителя	S1+QS0+Q	v3=k3[S1][Q]

В стационарном состоянии скорость генерации возбужденных молекул-люминофоров должна быть равна скорости их инактивации. Поскольку предполагается, что тушители не влияют на характер поглощения света исследуемым люминофором, скорость их генерации должна быть, таким образом, одинаковой как в присутствии тушителя, так и в его отсутствие. Следовательно, в стационарном состоянии и скорости инактивации возбужденных молекул люминофора в отсутствие и в присутствии тушителей должны совпадать. Таким образом, можно написать:

(80)

В выражении (80) [S₁] и [S₁]^ - стационарные концентрации возбужденных молекул люминофора соответственно в присутствии и в отсутствие тушителя. Введем новую константу К, которая будет равна:

Теперь, используя эту константу, выразим в явном виде зависимость [S₁]^ от [S₁] и [Q]. Получим:

(81)

.

Поскольку интенсивность фотолюминесценции J_фл связана со скоростью инактивации возбужденных молекул люминофора через величину квантового выхода фотолюминесценции, а величины квантовых выходов фотолюминесценции будут в отсутствие (q)и в присутствии (q^) тушителя будут соответственно равны:

;

на основании выражения (81) легко показать, что отношение интенсивностей фотолюминесценции в отсутствие и в присутствии тушителя (J_фл и J_фл^) будет равно отношению стационарных концентраций возбужденных состояний молекул люминофора в соответствующих условиях:

(82)

Приведем выражение (82) к несколько иному, более удобному виду:

(83)

Выражение (83), показывающее зависимость интенсивности фотолюминесценции люминофора от концентрации тушителя в образце, носит название закона Штерна-Фольмера. Константа К в этом законе называется константой тушения. Величина этой константы – мера эффективности тушения фотолюминесценции данного люминофора данным тушителем в данных конкретных условиях. Для определения величины К в эксперименте строится зависимость отношения J_фл/J_фл^ от концентрации тушителя ([Q]). Эта зависимость, если причиной ослабления вторичного свечения является истинное тушение фотолюминесценции, должна быть линейной, а тангенс угла ее наклона и есть искомая величина К.

К числу тушителей фотолюминесценции относится много веществ, достаточно распространенных в биологических объектах: тяжелые катионы и анионы (например, I^-, Br^-, Cs⁺, Cu²⁺), парамагнитные ионы и молекулы (O₂, Mn²⁺), нитроксильные радикалы, гем. Кроме того, эффективно тушат фотолюминесценцию многие растворители, в т.ч. вода.

Последнее обстоятельство особенно сильно осложняет флуориметрические измерения, поскольку количественно оценить эффективность тушения фотолюминесценции растворителем сложно. Поэтому тушащий эффект растворителя оценивается косвенно, по изменению квантового выхода фотолюминесценции в данном растворителе в сравнении с другими. Поскольку растворитель всегда имеется в образце-растворе в достаточно большом количестве, его часто и не считают тушителем, обозначая так только другие имеющиеся в объекте растворенные молекулы. Вместе с тем, именно из-за тушения фотолюминесценции растворителями квантовые выходы вторичного свечения для многих молекул в растворах часто бывают не больше долей процентов. Надёжно зарегистрировать же фотолюминесценцию у вещества обычно возможно только при величине q0,01. Соединения, у которых этот показатель в растворе оказывается ниже, принято считать не способными к фотолюминесценции, хотя на самом деле какое-то количество квантов вторичного свечения они испускают.

По механизму перехвата энергии электронного возбуждения у возбужденных молекул-люминофоров все тушители могут быть разделены на 2 группы.

При тушении фотолюминесценции динамического типа (тушении II рода) передача энергии электронного возбуждения с люминофора на тушитель осуществляется в ходе соударений этих молекул. При таком типе тушения по мере роста концентрации тушителя в системе величины q и  у молекул люминофора снижаются параллельно друг другу.

При статическом тушении (тушении I рода) растрата энергии электронного возбуждения происходит вследствие формирования устойчивого неспособного к фотолюминесценции комплекса тушителя с люминофором. Попробуем оценить такой вид тушения количественно. Пусть ЛФ – молекулы люминофора, Q - молекулы тушителя, НФ – неспособный к фотолюминесценции комплекс, формируемый из ЛФ и Q. Взаимодействие между люминофором и тушителем в таком случае может быть описано реакцией:

В равновесном состоянии должно выполнятся следующее условие:

(84)

где К_Д – константа диссоциации комплекса НФ.

Если предположить, что формирование комплекса не отражается на способности люминофора к поглощению возбуждающего излучения, из выражения (84) можно получить следующее:

(85)

В этом выражении q и q^ - величины квантового выхода фотолюминесценции в присутствии и в отсутствие тушителя.

Уравнение (85) не будет выполняться, если поглощение возбуждающего света комплексом люминофор-тушитель будет отличаться от такового у чистого люминофора. Но при малых оптических плотностях системы в таких случаях можно написать:

(86)

где J_фл и J_фл^ - соответственно интенсивности фотолюминесценции в отсутствие и в присутствии тушителя.

После преобразований выражения (86) его можно привести к виду:

(87)

Видно, что выражение (87) полностью соответствует по своей форме математическому выражению закона Штерна-Фольмера (уравнение (83) выше). Таким образом, путём исследования зависимостей интенсивности фотолюминесценции от концентрации тушителя в образце различить статическое и динамическое тушение невозможно. Однако, если имеется возможность измерения величины времени жизни возбужденных состояний в изучаемом объекте, то данная задача может быть решена. Дело в том, что величина  при статическом тушении не зависит от концентрации тушителя – падает только квантовый выход фотолюминесценции. В случае же динамического тушения, как уже отмечалось, с ростом содержания тушителя в образце квантовый выход свечения и реальное время жизни возбужденных состояний снижаются параллельно.

Один из видов статического тушения носит название концентрационное тушение. Ослабление фотолюминесценции вследствие этого вида тушения наблюдается при высоких концентрациях люминофора и связано с формированием в таких условиях димеров и более крупных молекулярных агрегатов люминесцирующих молекул, которые оказываются не способны к вторичному свечению.

Концентрационное тушение – весьма распространенное явление, которое используется в ряде случаев для изучения транспортных процессов в клетках и их органеллах. Например, краситель 9-аминоакридин интенсивно накапливается в клеточной цитоплазме и/или в митохондриях при условии, что цитоплазма клеток или внутримитохондриальное пространство имеют более низкое рН, чем среда инкубации. В ходе переноса красителя его концентрация внутри клеток или внутри органелл становится достаточной для развития концентрационного тушения фотолюминесценции. В результате появляется возможность измерять величину рН внутри клеток или их органелл по степени тушения фотолюминесценции данного красителя, который, таким образом, может рассматриваться как флуоресцентный зонд для измерения рН. Аналогично, цианиновые красители (например, diS-C₃(5)), молекулы которых при нейтральных рН имеют положительный заряд, накапливаются в клетках и органеллах с отрицательно заряженной стороны мембран (т.е. обычно – внутри клеток и органелл). Степень этого накопления зависит от величины трансмембранной разности потенциалов. Соответственно, оценивая степень тушения фотолюминесценции этого красителя в суспензиях клеток или их органелл, можно оценить и величину трансмембранной разности потенциалов у исследуемого объекта. Это свойство позволяет использовать цианиновые красители в качестве флуоресцентных зондов на мембранный потенциал.

Миграция энергии электронного возбуждения

Явление миграции энергии электронного возбуждения весьма распространено в биологических образцах сложного состава. Оно заключается в том, что поглотившая квант возбуждающего света и находящаяся в состоянии возбуждения молекула-донор безизлучательно отдаёт энергии на другую молекулу – молекулу-акцептор, которая затем может испустить квант фотолюминесценции. Важной особенностью миграции энергии является отсутствие необходимости столкновений молекулы-донора и молекулы-акцептора для передачи энергии. Обычно такая передача осуществляется на небольшие, но превышающие межатомные, расстояния. Чаще всего, миграция энергии становится возможна в тех случаях, когда между донором и акцептором образуется устойчивый комплекс, время существования которого значительно больше времени жизни возбужденного состояния донора. Если анализируется фотолюминесценция донора электронной энергии, то наличие ее миграции приводит к уменьшению реального квантового выхода фотолюминесценции этого соединения и, соответственно, к снижению регистрируемой интенсивности его фотолюминесценции.

Наиболее вероятным механизмом передачи энергии электронного возбуждения от донора к акцептору считается индуктивно-резонансный перенос. Ниже мы рассмотрим этот процесс подробнее. Здесь же укажем только на то, что, во-первых, поскольку речь идет о переносе энергии электронного возбуждения, которая квантована, для реализации переноса электронного возбуждения по этому механизму требуется, чтобы порции (кванты) этой энергии, которыми ее в состоянии отдавать донор были приемлемы для акцептора. В терминах спектров, характеризующих свойства донора и акцептора, это означает, что спектр фотолюминесценции молекулы-донора должен иметь область перекрывания со спектром поглощения (или, что то же самое, со спектром возбуждения фотолюминесценции) молекулы-акцептора. Если это условие не выполняется, рассматривать данную пару соединений как донорно-акцепторную в плане миграции энергии не имеет смысла. Если же условие выполнено, это еще не означает, что миграция энергии обязательно имеется. Для проверки ее наличия удобно проанализировать вид спектров возбуждения вещества-потенциального акцептора энергии электронного возбуждения в 2 системах: (1) в чистом виде; (2) в смеси с потенциальным соединением-донором. В чистом виде спектр возбуждения фотолюминесценции потенциального акцептора будет описываться известным выражением:

(88)

D_A здесь – оптическая плотность вещества-акцептора в образце.

Если же регистрируется спектр возбуждения фотолюминесценции акцептора в смеси с донором, возможны 2 ситуации. В отсутствие миграции энергии электронного возбуждения этот спектр будет описываться выражением:

(89)

В правой части выражения (89) имеется поправка на экранирование возбуждающего излучения присутствующим в смеси посторонним соединением с оптической плотностью D_Д.

Если же миграция энергии между молекулами донора и акцептора имеется, то спектр возбуждения фотолюминесценции акцептора в смеси с донором будет описываться несколько другим выражением:

(90)

В выражении (90) величина q_м – квантовый выход миграции энергии электронного возбуждения в рассматриваемой системе. Поскольку миграция энергии электронного возбуждения – один из путей реализации этого возбуждения для молекул-доноров, то q_м можно определить, как отношение числа молекул-доноров, отдавших энергию возбуждения на акцептор путем ее миграции, к общему числу возбужденных молекул-доноров в рассматриваемой системе. Величина q_м – единственный количественный критерий эффективности миграции энергии электронного возбуждения в рассматриваемой донорно-акцепторной паре. Определить значение q_м можно на основании дальнейшего рассмотрения спектров возбуждения фотолюминесценции акцептора в чистом виде и в смеси с донором.

После небольшого преобразования выражение (90) можно привести к следующему виду:

(91)

Выражение (91) отличается от выражения (89), описывающего вид спектра возбуждения фотолюминесценции акцептора в смеси с донором в отсутствие миграции энергии электронного возбуждения вторым слагаемым в правой части ().Это слагаемое определяет появление на спектре возбуждения фотолюминесценции акцептора при наличии миграции энергии новой, ранее отсутствовавшей, полосы (максимума), спектральное положение которой детерминируется D_Д. Иными словами, на этом спектре акцептора появляется полоса, аналогичная полосе поглощения донора. Наличие данной полосы в спектре возбуждения фотолюминесценции акцептора в смеси с донором указывает на то, что миграция энергии электронного возбуждения в данной паре веществ, вероятнее всего, имеется. Впрочем, как уже указывалось, для осуществления миграции энергии требуется, чтобы между молекулами донора и акцептора в смеси формировался достаточно устойчивый комплекс, в составе которого соответствующие люминофорные группы этих молекул были бы расположены достаточно близко друг от друга. Вместе с тем, нередко формирование комплекса двух хромофоров приводит к тому, что вид спектров их поглощения меняется – происходит смещение максимумов поглощения. Для проверки того, не возникает ли необычный максимум в спектре возбуждения фотолюминесценции акцептора в смеси с донором из-за смещения полос его поглощения при образовании комплекса, следует измерить спектры поглощения донора и акцептора в чистом виде и в смеси, и убедиться, в том, что спектр поглощения смеси соответствует сумме спектров поглощения донора и акцептора в чистом виде. Если же на спектре поглощения смеси выявляются максимумы, не характерные для донора и акцептора в чистом виде, тогда следует внести соответствующие поправки в выражения (90) и (91).

В тех случаях, когда новая полоса на спектре возбуждения фотолюминесценции акцептора оказывается связана с миграцией электронного возбуждения с молекул донора, квантовый выход миграции энергии может быть рассчитан по формуле:

(92)

В выражении (92):

• J^_фл – интенсивность фотолюминесценции акцептора при ее возбуждении излучением в области поглощения донора;

• J_фл – интенсивность фотолюминесценции акцептора в чистом виде при таком же возбуждении;

• D_A – оптическая плотность акцептора в чистом виде;

• D^_А – оптическая плотность акцептора в смеси с донором;

• D_Д – оптическая плотность донора в смеси с акцептором.

Выражение (92) применимо, если собственный квантовый выход фотолюминесценции акцептора в смеси с донором не изменяется.

Зависимость вероятности миграции энергии электронного возбуждения от расстояния между донором и акцептором энергии. Уравнение Фёрстера.

Как уже указывалось выше, каждая молекула или атом могут рассматриваться как осциллирующий диполь, у которого положительный полюс – суммарный положительный заряд ядер (ядра), а отрицательный – совокупный отрицательный заряд электронов. Поскольку из-за подвижности ядер и электронов положение полюсов диполя постоянно изменяется, направление вектора такого диполя и величина его дипольного момента будут меняться во времени, т.е. диполь будет осциллирующим (переменным). Частота осцилляций в этом случае определяется структурой молекулы и температурой среды. При электронном возбуждении величина дипольного момента и частота осцилляций молекулы-диполя также подвержены изменению. Принято называть осциллирующий диполь, которым молекула становится после поглощения фотона и перехода в состояние электронного возбуждения, индуцированным диполем. Согласно теории индуктивно-резонансного механизма миграции энергии электронного возбуждения перенос энергии возбуждения осуществляется за счет близости собственной частоты осцилляций у индуцированного диполя возбужденной молекулы-донора и осциллирующего диполя молекулы-акцептора. При такой близости возможно возникновение явления резонанса переменных электромагнитных полей, создаваемых каждым из взаимодействующих диполей, вследствие которого часть дипольного момента переносится с донора на акцептор. Для того, чтобы резонанс осуществился, требуется выполнение ряда условий:

1. Соединение-донор энергии должно быть способно к фотолюминесценции. Обозначим величину квантового выхода фотолюминесценции донора в отсутствие акцептора как q_Д. Тогда реальное время жизни () возбужденных молекул донора составит = q_Д_и, где _и – истинное время жизни таких молекул. Понятно, что вероятность реализации миграции энергии электронного возбуждения на акцептор будет тем выше, чем больше . Соответственно, q_Д должен быть больше 0 и, желательно, как можно более близок к 1.

2. В терминах спектров поглощения и фотолюминесценции основное условие резонанса – близость собственных частот осцилляций у возбужденного донора и невозбужденного акцептора – означает, что должна иметься достаточно значительная область перекрывания между спектром фотолюминесценции донора и спектром поглощения акцептора. Чем выше степень перекрывания указанных спектров, тем, при прочих равных условиях, вероятнее миграция энергии электронного возбуждения с донора на акцептор. Количественно степень перекрывания рассматриваемых спектров донора и акцептора может быть определена по формуле:

(93)

В выражении (93) - зависимость интенсивности фотолюминесценции донора от частоты излучения, т.е. спектр его фотолюминесценции; - зависимость от частоты излучения молярного коэффициента поглощения акцептора, т.е. спектр его поглощения. Величину же S_АД принято обозначать как интеграл перекрывания. При нормировке спектров фотолюминесценции донора удобно использовать отношение S_АД/S_Д, где S_Д – площадь под кривой зависимости J_фл^Д=f().

3. Поскольку взаимодействие между осциллирующими диполями быстро ослабевает по мере увеличения расстояния между ними, важно, чтобы молекула-донор и молекула-акцептор находились достаточно близко друг к другу. Согласно теории индуктивно-резонансного переноса, разработанной Т. Фёрстером, константа скорости этого переноса k_п зависит от расстояния между донором и акцептором следующим образом:

(94)

В выражении (94) Ф² – так называемый ориентационный фактор, а =(9000ln10)/(128⁵n⁴N_A), где n – коэффициент преломления света в среде, а N_A – число Авогадро (6,0210²³ моль^-1).

4. Для того, чтобы резонансный перенос энергии произошел, необходимо, чтобы векторы дипольных моментов донора и акцептора были параллельны друг другу. Это условие в выражении (94) учтено с помощью введения ориентационного фактора Ф². Если вектора дипольных моментов донора и акцептора ориентированы перпендикулярно, Ф² будет равен 0. В растворах с хаотически расположенными вращающимися молекулами принимается, что Ф²=2/3.

Зависимость квантового выхода миграции энергии (q_м) от расстояния может быть описана формулой:

(95),

где - константа скорости излучательного перехода у возбужденных молекул донора; - константа скорости безизлучательного тушения возбужденных молекул донора. На основании выражений (94) и (95) определим такое расстояние между молекулами донора и акцептора, при котором q_м будет равен 0,5:

(96),

Величина R₀ в выражении (96) носит название радиус Фёрстера. Если R₀ известен, то по тушению собственной фотолюминесценции соединения донора в присутствии акцептора можно определить среднее расстояние между молекулами донора и акцептора в исследуемой системе:

(97)

В выражении (97) - интенсивность фотолюминесценции донора в чистом виде; - интенсивность фотолюминесценции донора в смеси с акцептором.

Нужно заметить, что выражения (94)(97) предполагают, что взаимодействуют одна возбужденная молекула-донор и одна невозбужденная молекула-акцептор, причем расстояния между молекулами в парах донор-акцептор всегда одинаковы. К сожалению, указанные условия на практике реализуются достаточно редко. В реальных системах каждая молекула-донор взаимодействует не с одной, а с несколькими молекулами-акцепторами. Из-за этого уравнение (97) усложняется. Более подробное описание миграции энергии электронного возбуждения в сложных системах можно найти в монографии Г.Е. Добрецова (Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М., 1989 г.).