2.4. Некоторые специальные методы спектрофотометрии

Как уже указывалось выше, спектры поглощения биологических объектов часто бывают плохо разрешены, из-за чего решение качественной (а, часто, и количественной, см. выше) задачи оказывается затруднительным. В таких случаях удобно использовать специальные приемы, позволяющие добиться положительного результата, несмотря на особенности спектров поглощения биологических образцов.

Низкотемпературная спектрофотометрия

Низкотемпературная спектрофотометрия – метод спектрофотометрического анализа, основанный на регистрации поглощения света предварительно сильно охлажденными образцами. Обычно для охлаждения образца применяется жидкий азот (его температура -196^о С или 77^о К). При такой температуре межмолекулярные взаимодействия в объекте ослабляются, тепловая энергия электронов снижается, соответственно, снижается и их способность к заселению тепловых колебательных подуровней в молекулах-хромофорах. В результате разрешение полос на спектрах поглощения существенно увеличивается, вплоть до появления так называемых квазилинейчатых спектров (рис. 7).

Рисунок 7. Спектры поглощения тимина в плёнке при комнатной температуре (1) и при температуре 77^оК (2). Обратите внимание на структурализацию полосы поглощения хромофора, придающую ей квазилинейчатый вид. Отдельные линии соответствуют переходам электрона между разными колебательными подуровнями основной и возбужденной электронных орбиталей.

Публикуется с модификациями по: Рощупкин Д.И., Потапенко А.Я., Клебанов Г.И. Практикум по биофизике. Часть 1. Лабораторные работы по спектральным методам исследования и фотобиологии. М.: 1975, с. 21.

К сожалению, метод низкотемпературной спектрофотометрии не лишен недостатков.

Первый из них состоит в технической сложности поддержания низкой температуры образца во время измерения его спектра поглощения (в частности, требуется установка специальных приспособлений, предупреждающих запотевание оптических частей прибора). Усложнение же спектрофотометра неизбежно приводит к увеличению его стоимости.

Второй недостаток данного метода увеличения разрешения спектров поглощения связан с тем, что при глубоком замораживании биологического объекта может быть нарушена его структура. В результате утрачивается значимое преимущество применения спектрофотометрического анализа в биологии - неинвазивность исследования.

Производная спектрофотометрия

Производная спектрофотометрия состоит в том, что регистрируются не только собственно спектр поглощения (D=f()), но также его первая и вторая производные по длине волны (и соответственно).

Регистрация первой производной спектра поглощения позволяет точно определить спектральное положение максимумов исходного спектра поглощения, поскольку на этой производной данные максимумы будут нулями функции. Вместе с тем, внешний вид первой производной спектра поглощения не похож на вид исходного спектра. Для получения дополнительных качественных признаков необходимо получить вторую производную этого спектра. На этой производной минимумы будут соответствовать максимумам исходного спектра (поэтому ее обычно анализируют с измененным знаком), однако, полуширина этих полос оказывается значительно ниже, чем на исходном спектре поглощения. В среднем, величина _1/2 на второй производной спектра поглощения (_1/2”) оказывается в 2-4 раза меньше, чем на исходном спектре. Обычно _1/2”= (0,50,7)_1/2 (где _1/2 – полуширина полос поглощения на исходном спектре). В результате разрешение спектра оказывается существенно лучше, и оказывается возможным определение соотношения амплитуд максимумов и их полуширины, которые невозможно было измерить на исходном спектре поглощения. Естественно, эти величины при решении качественных задач с помощью производной спектрофотометрии следует сопоставлять с соответствующими показателями второй производной стандартного спектра поглощения выявляемого хромофора.

Таким образом, регистрация производных спектров поглощения исследуемого объекта часто позволяет получить все требуемые для решения качественной спектрофотометрической задачи признаки – точное спектральное положение максимумов, их полуширины и отношение амплитуд.

Для регистрации производных спектров поглощения применяются 2 основных приема.

Прямой метод регистрации заключается в том, что прибор регистрирует разность в оптической плотности объекта (D=D_1-D_2) при небольшом смещении по длине волны (=1 -2). Если  достаточно мало и постоянно по всей области измерения (а спектр регистрируется за счет синхронного изменения 1 и 2), то вид зависимости D=f() будет близок к виду производной спектра поглощения (тем ближе, чем меньше ). Следует заметить, что при применении подобного приёма следует учитывать возможные различия в интенсивности излучения источника при 1 и 2, а также возможные различия в чувствительности примененного фотодетектора к квантам излучения с 1 и 2.

При непрямом методе регистрации производных спектра тем или иным образом получают электрический сигнал U, величина которого прямо пропорциональна величине D образца. Иными словами, требуется, чтобы выполнялось соотношение U=kD, где k – коэффициент пропорциональности между D и U. Требуется также, чтобы скорость развертки спектра во времени была постоянно, т.е. чтобы было справедливо выражение t=h, где h - коэффициент пропорциональности между t и . Далее регистрируется производная сигнала U по времени (). Указанные выше условия пропорциональности позволяют сделать следующие преобразования:

,

где R - коэффициент пропорциональности между и(он будет равен k/h).

Таким образом, при регистрации производной спектра непрямым способом регистрируется не собственно величина производной ,а прямо пропорциональная ей величина .Однако производная спектрофотометрия обычно применяется для решения качественных задач, где важен качественный вид спектра, а не амплитуды полос поглощения. Кроме того, при необходимости значение R может быть достаточно просто определено. Заметим в заключение, что дифференцирование спектров поглощения с помощью компьютерных программ является разновидностью непрямого метода получения производных спектров.

Разностная (дифференциальная) спектрофотометрия

Как уже неоднократно указывалось выше, биологические объекты отличаются сложным составом и обычно содержат много типов хромофорных молекул. Из-за этого нередко вклад в общую оптическую плотность образца поглощения какой-либо молекулы одного типа оказывается мал. При этом плохое разрешение спектров поглощения биологических образцов делает невозможным выбор такой длины волны тестирующего излучения, при которой вся измеряемая оптическая плотность была бы связана с конкретным хромофором. Вместе с тем, часто необходимо бывает исследовать изменения в образце, затрагивающие только молекулы одного, конкретного, типа. Например, может потребоваться регистрация сдвигов в окислительно-восстановительном статусе цитохрома с в составе митохондриальных мембран, а вклад поглощения этого цитохрома в общее ослабление света в видимой области спектра митохондриальной суспензией незначителен.

В подобных случаях можно прибегать к приёму, который называется разностной или дифференциальной спектрофотометрией. Суть метода в том, что в качестве образца сравнения (величина светового потока через который принимается за ₀) при регистрации спектра поглощения объекта используется не просто кювета c растворителем, а такой же, как и исследуемый, образец, но до воздействия на него модифицирующим изучаемое вещество воздействием. В этом случае поглощение всех веществ объекта, которые модифицирующему воздействию подвержены не были, будет принято прибором за 0, а регистрироваться будут только те изменения в спектре поглощения, которые произошли в результате модификации.

Примером применения подобного подхода может быть известный метод выявления тирозиновых остатков в белках.

Тирозин, будучи производным фенола, является слабой кислотой, диссоциирующей при щелочных рН (отщепляется протон от гидроксильной группы). Поэтому для выявления присутствия тирозиновых остатков в исследуемом белке достаточно зарегистрировать спектр поглощения в ультрафиолетовом спектральном диапазоне его раствора в среде с рН13, используя в качестве образца сравнения такой же раствор, но в среде с рН около 7. Если в полипептидной цепи исследуемого белка имеются тирозиновые остатки, на полученном разностном спектре поглощения будет иметься максимум около 290 нм, связанный с появлением в щелочной среде тирозинат-аниона. Поглощение же других аминокислотных остатков при увеличении рН меняется слабо и на вид разностного спектра значимого влияния оказывать не будет.

Следует заметить, что применение разностной спектрофотометрии улучшает точность измерения оптической плотности. Данные, указывающие на это, приведены на рис. 8.

Рисунок 8. Зависимость среднеквадратичной ошибки (, %) спектрофотометрического анализа от величины регистрируемой оптической плотности (D_р) при обычном варианте регистрации (кривая 1) и разностной спектрофотометрии (кривая 2 – оптическая плотность образца сравнения 0,25; кривая 3 – оптическая плотность образца сравнения 2,0). Обратите внимание, что ошибка измерения оптической плотности особенно низка в тех случаях, когда D_р мала, а оптическая плотность образца сравнения – велика (ср. кривые 2 и 3).

Публикуется с модификациями по: Бабко А.К., Пилипенко А.Т. Фотометрический анализ. М.: «Химия», 1968, с. 231-238.

Поскольку при разностной спектрофотометрии регистрируется разность оптических плотностей объекта (D_об) и образца сравнения (D_ср), т.е. меряется D=D_об – D_ср, значения измеряемого показателя D могут быть и отрицательными (при обычной спектрофотометрии величина D не может быть отрицательной по определению, см. уравнение (18)). В случае, если применяемый спектрофотометр не позволяет регистрировать отрицательные значения D, для регистрации разностных спектров поглощения в спектральных участках, где D отрицательна, требуется поменять кюветы с исследуемым объектом и образцом сравнения в кюветном отделении прибора местами.

Разностная спектрофотометрия позволяет успешно решать не только качественные, но и количественные задачи. Для решения количественной задачи, однако, требуется знание дифференциального коэффициента поглощения (_диф), который обычно определяется в отдельном эксперименте, путем воздействия модификатором на исследуемый хромофор в чистом виде. Если _диф известен, то концентрация хромофора (с) в образце может быть рассчитана по формуле: