Все экспериментальные данные сводят в таблицу 7.

Таблица 7 – Выход и качество сока из яблок различной предварительной обработки

Способ обработки	Выход сока, %	Качественные показатели сока
		Сухие вещества, %	Общая кислотность, %	рН

По результатам работы делают выводы о влиянии способа обработки яблок на выход и качество сока, устанавливают оптимальный способ обработки.

Лабораторная работа №6

установление подлинности концентрированных фруктовых соков

Фруктовый сок - жидкий продукт, несброженный, но способный к брожению, полученный из съедобной части доброкачественных спелых, свежих или сохраненных свежими фруктов путем физического воздействия, соответствующий в основном по органолептическим, физико-химическим свойствам и пищевой ценности одноименным фруктам, консервированный физическими способами, кроме обработки ионизирующим излучением, предназначенный для непосредственного употребления в пищу или для промышленной переработки.

Концентрированный фруктовый сок - фруктовый сок, из которого путем физического воздействия удалена часть содержащейся в нем воды с целью увеличения содержания растворимых сухих веществ не менее, чем на 50 %.

Восстановленный фруктовый сок - продукт, полученный путем восстановления концентрированного фруктового сока подготовленной питьевой водой в соотношении, обеспечивающем сохранение основных органолептических, физико-химических свойств и пищевой ценности сока из одноименных фруктов с добавлением или без добавления концентрированных натуральных ароматообразующих веществ, соков прямого отжима или пюре.

Качество продовольственного сырья и пищевых продуктов -совокупность свойств и характеристик продовольственного сырья и пищевых продуктов, которые обусловливают способность удовлетворять физиологические потребности человека при обычных условиях их использования.

Идентификация - исследование качества с целью установления соответствия состава продукта заявленному наименованию.

Подлинность (аутентичность) сока - сохранение в соке основных органолептических и физико-химических свойств фрукта(ов) из которого данный сок изготовлен.

Оценка качества сока - экспертная интерпретация результатов исследования качества и/или результатов идентификации путем их сравнивания с базами показателей сопоставления с учетом сведений о технологии производства, переработки, сортовых особенностях, климатических условий выращивания и сельскохозяйственного производства с целью идентификации соков, определения подлинности и соответствия количественным требованиям, предъявляемым к содержанию соков, установления присутствия неспецифичных соединений или факторов недопустимой модификации природного состава продукта.

Химический состав фруктового сока определяет сортовые особенности, фрукта (ов), из которого данный сок произведен, а также географический регион и климатическая зона выращивания фруктов, почва, погода, степень спелости, технология его извлечения, консервирования и хранения и другие природные и технологические факторы. Для соков, подвергнутых технологической обработке, не представляется возможным установить универсальные стандарты для оценки их подлинности. Вместе с тем, возможно определение минимальных и максимальных значений и/или интервалов для отдельных физико-химических показателей, характеризующих состав соков.

Химический состав концентрированного фруктового сока должен обеспечить получение восстановленного фруктового сока, обладающего, по меньшей мере, одинаковыми органолептическими и физико-химическими свойствами в сравнении со средним фруктовым соком, произведенным из со­ответствующих фруктов.

Органолептические показатели концентрированных фруктовых соков должны соответствовать требованиям ТНПА.

Рекомендуемый первоочередной перечень физико-химических показателей, используемых для идентификации концентрированных фруктовых соков и их значения в расчете на восстановленный до исходного уровня растворимых сухих веществ сок указаны в приложении 1.

Цель работы: Установить подлинность концентрированных фруктовых соков органолептически и физико-химическими методами.

Метод определения L-яблочной кислоты

Материалы и оборудование: Спектрофотометр или фотометр фотоэлектрический для измерений при длинах волн 334, 340 или 365 нм, кюветы фотометрические из оптического стекла или пластмассы толщиной поглощающего слоя 1 см, шпатели пластиковые или палочки стеклянные оплавленные длиной от 5 . до 10 см, дозаторы пипеточные объемами доз 1,0; 0,2 и 0,01 см³ и относительной погрешностью дозирования ±1 % или пипетки градуированные номинальной вместимостью 2,0; 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 и 0,02 см³, весы лабораторные 2 класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г, колбы мерные номинальной вместимостью 25, 50, 100, 200 и 250 см³. Реактив 1 (30см³ глицилглицинового буферного раствора рН10, содержащего 440мг L-глутаминовой кислоты), реактив 2 (210мг лиофилизированного НАД), реактив 3 (0,4см³ раствора суспензии глутаматоксалоацетаттрансаминазы (ГОТ) активностью 160U), реактив 4: 0,4см³ раствора L-малатдегидрогеназы (L-МДГ), активностью 2400U)

Порядок выполнения работы

Концентрированный сок восстанавливают дистиллированной водой до массовой доли растворимых сухих веществ в соответствии с таблицей 8.

Таблица 8 - Массовая доля растворимых сухих веществ восстановленных соков

	Наименование сока	Массовая доля растворимых сухих веществ, %
	Апельсиновый	11,2
	Грейпфрутовый	10,0
	Яблочный	11,2
	Ананасовый	12,8
	Вишневый	13,5

В фотометрической кювете должно находиться от 1,0 до 35,0 мкг (измерения при 365 нм) или от 0,5 до 20,0 мкг (измерения при 334, 340 нм) L-яблочной кислоты. Для достижения необходимой разницы оптических плотностей, не менее 0,100 ед., восстановленный сок разбавляют так, чтобы концентрация L-яблочной кислоты лежала в интервале 0,08 - 0,35 г/дм³ (измерения при 365 нм) и 0,04 - 0,2 г/дм³ (измерения при 334, 340 нм). Рабочий раствор для фотометрического определения получают в соответствии с таблицей 9, учитывая предполагаемую массовую концентрацию L-яблочной кислоты.

Таблица 9 - Рабочие концентрации L-яблочной кислоты

Предполагаемая концентрация ; L-яблочной кислоты в восстановленном соке, г/дм3		Разбавление водой	Фактор разбавления (F)
340 или 334 нм	365 нм
<0,2 0,2 – 2,0 2,0 – 20,0 20	<0,35 0,35 – 3,5 3,5 – 35,0 35	- 1 + 9 1 + 99 1 + 999	1 10 100 1000

Максимум поглощения НАДН находится при длине волны 340 нм. При использовании спектрофотометра переменной длины волны все измерения проводят в максимуме поглощения НАДН. При использовании спектрофотометра с ртутной лампой измерения проводят при длинах волн 334 или 365 нм. Определение проводят при температуре 20 - 25°С. Общий объем смеси в кювете составляет 2,220 см³. Оптическую плотность измеряют относительно воздуха. Дозирование реактивов в контрольную кювету и кювету с пробой осуществляют в соответствии с таблицей 10.

Таблица 10 - Дозирование реактивов

Реактивы, дозируемые в кювету	Обозначения кювет
	Контроль		Проба
Реактив 1	1,000см3		1,000см3 .
Реактив 2	0,200 см3		0,200 см3
Реактив 3	0,010 см3		0,010см3
Раствор пробы	-		0,100см3
Дистиллированная вода	1,000см3		0,900 см3
Перемешивают, выдерживают в течение 3 мин, измеряют оптическую плот-юность растворов контроля и пробы ei. Начинают реакцию с добавления
Реактив 4		0,010см3	0,010см3
Перемешивают, выдерживают в течение 5-10 мин, измеряют оптическую плотность растворов контроля и пробы Е2-

Рассчитывают разность измеренных величин оптических плотностей (Е₂->E₁) для контроля и пробы. Вычитая значение разницы оптических плотностей контроля из значения разницы оптических плотностей пробы, получают Е.

Е = (Е₂ – Е₁)_пр – (Е₂ – Е₁)_конт.

Если разница оптических плотностей значительно меньше 0,100 ед, то следует повторно приготовить пробу, уменьшив разбавление. При необходимости можно увеличить объем пробы, вносимой в спектрофотометрическую кювету, до 1,000 см³. При этом количество вносимой дистиллированной воды следует уменьшить так, чтобы общий объем раствора в кювете (V = 2,220см³) остался без изменений.

Массовую концентрацию L-яблочной кислоты в восстановленном соке С, г/дм³, вычисляют по формуле:

,

где V - общий объем смеси в кювете;

М- молярная масса L-яблочной кислоты , М = 134,09 г/моль;

е - молярный коэффициент поглощения НАДН, равный

при 340 нм - 6,30 дм³  ммоль^-1  см^-1;

при 365 нм - 3,4 дм³  ммоль^-1  см^-1;

при 334 нм - 6,18 дм³  ммоль^-1  см^-1;

d-толщина поглощающего слоя в кювете (ширина грани), см;

v - объем пробы в кювете, см³;

Е - разница оптических плотностей;

F- фактор разбавления пробы в ходе подготовки к определению.

Метод определения лимонной кислоты

Метод определения лимонной кислоты в виде свободной кислоты или соли основан на ферментативном преобразовании иона цитрата с помощью цитрат-лиазы (ЦЛ) в оксалоацетат. Затем оксалоацетат и продукт его декарбоксилирования пируват под действием ферментов L-малатдегидрогеназы (L–МДГ) и L-лактатдегидрогеназы (L-ЛДГ) с помощью НАДН количественно преобразуется в L-малат и L-лактат.

Количество окисленного никотинамидадениннуклеотида (НАД⁺), эквивалентное количеству лимонной кислоты, определяют измерением оптической плотности при 334, 340 или 365 нм.

Материалы и оборудование: Поливинилполипирролидон (ПВПП), Реактив 1: 1,4 лиофилизата, содержащего глицилгилиновый буфер с рН 7,8 L-МДГ активностью 136 U, L-ЛДГ активностью 280 U, 5мг НАДН (3 порции), Реактив 2: 50 мг лиофилизата ЦЛ активностью 12 U (3 порции).

Порядок выполнения работы

Реактив 1 растворяют в 12 см³ дистиллированной воды. Реактив 2 растворяют в 0,3 см³ дистиллированной воды.

В фотометрической кювете должно находиться от 1 до 80 мкг лимонной кислоты. Для достижения необходимой разницы оптических плотностей , не менее 0,100 ед., восстановленный сок разбавляют так, чтобы концентрация искомого соединения лежала в интервале 0,04 - 0,4 г/дм³. Рабочий раствор для фотометрического определения получают в соответствии с таблицей 11, учитывая предполагаемую массовую концентрацию лимонной кислоты.

Мутные соки фильтруют, при необходимости разбавляют в соответствии с таблицей разбавлений 11. Интенсивно окрашенные соки предварительно обесцвечивают. Для этого к 10,0 см³ сока добавляют 0,1 г поливинилполипирролидона, перемешивают в течение 1 мин и фильтруют. Для определения используют прозрачный, слегка окрашенный фильтрат. Яблочный сок исследуют неразбавленным после предварительного обесцвечивания.

Таблица 11 - Рабочие концентрации лимонной кислоты

Предполагаемая концентрация лимонной кислоты в восстановленном соке, г/дм3	Разбавление водой	Фактор разбавления (F)
<0,4	-	1
0,4 - 4,0	1+9	10
4,0-40,0 >40,0	1+99 1+999	100 1000

Максимум поглощения НАДН находится при длине волны 340 нм. При использовании спектрофотометра переменной длины волны все измерения доводят в максимуме поглощения НАДН. При использовании спектрофотометра с ртутной лампой измерения проводят при длинах волн 334 или 365 нм. Используют стеклянную (пластиковую) кювету с толщиной оптического слоя |1см. Определение проводят при температуре 20 - 25°С. Общий объем смеси в кювете составляет 3,020 см³. Оптическую плотность измеряют относительно воздуха. Дозирование реактивов в контрольную кювету и кювету с пробой осуществляют в соответствии с таблицей 12.

Таблица 12 - Дозирование реактивов

Реактивы, дозируемые в кювету	Обозначения кювет
	Контроль		Проба
Реактив 1	1,000см3		1,000см3
:Раствор пробы	-		0,200см3
Дистиллированная вода	2,000 см3		1,800см3
Перемешивают, выдерживают в течение 5 мин, измеряют оптическую плотность растворов контроля и пробы Е1. Начинают реакцию с добавления
Реактив 2		0,020см3	0,020 см3
Перемешивают, выдерживают в течение 5 мин, измеряют оптическую плотность растворов контроля и пробы Е2

Рассчитывают разность измеренных величин оптических плотностей (Е₂-Е₁) для контроля и пробы. Вычитая значение разницы оптических плотностей контроля из значения разницы оптических плотностей пробы, получают Е.

Е = (Е₂-Е₁)_пр – (Е₂-Е₁)_контр.

Если разница оптических плотностей значительно меньше 0,100 ед, то следует повторно приготовить пробу, уменьшив разбавление. При необходимости можно увеличить объем пробы, вносимой в спектрофотометрическую кювету, до 2,000 см³. При этом количество вносимой дистиллированной воды следует уменьшить так, чтобы общий объем раствора в кювете (V = 3,020см³) остался без изменений.

Массовую концентрацию лимонной кислоты в восстановленном соке С, г/дм³, вычисляют по формуле:

,

где V - общий объем смеси в кювете;

М- молярная масса лимонной кислоты , М = 192,1 г/моль;

 - молярный коэффициент поглощения НАДН, равный

при 340 нм - 6,30 дм³  ммоль^-1  см^-1;

при 365 нм - 3,4 дм³  ммоль^-1  см^-1;

при 334 нм - 6,18 дм³  ммоль^-1  см^-1;

d-толщина поглощающего слоя в кювете (ширина грани), см;

v - объем пробы в кювете, см³;

Е - разница оптических плотностей;

F- фактор разбавления пробы в ходе подготовки к определению.

Метод определения D – изолимонной кислоты

Метод основан на осаждении D-изолимонной кислоты в виде соли бария, перерастворении соли, ферментативном декарбоксилировании иона цитрата под действием никотинамиддадениндинуклеотидфосфата НАДФ⁺(окисленная форма) в присутствии изоцитратдегидрогеназы (ИЦДГ).

Связанную в виде эфиров или лактонов D-изолимонную кислоту определяют после щелочного гидролиза соответствующих соединений.

Количество образовавшегося НАДФН, эквивалентное количеству D-изолимонной кислоты, определяют измерением оптической плотности при 334,340 или 365 нм.

Материалы и оборудование: Иономер, центрифуга лабораторная 3000об. мин. Кислота соляная 4,0 моль/дм^3, аммиак водный ч.д.а, ацетон, ч.д.а, барий хлористый 2-водный 300г/дм³, натрия гидроокись 4 моль/дм³, натрий сернокислый 71г/дм³, марганец сернокислый 12,5 г/дм³, этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль 2-водная, ч.д.а., трис (гидроксиметиламинометан), поливинилполипирролидон (ПВПП), Ректив 1: 30,0см³ раствора имидазольного буфера рН 7,1, реактив 2: 2,6мг лиофилизата, содержащего 45 мг НАДФ и сульфат марганца, реактив 3: Лиофилизат ИЦДГ активность 5U.

Порядок выполнения работы

Реактив 2 растворяют в реактиве 1. реактив 3 растворяют 1,8см³ дистиллированной воды.

2,42г трис и 35мг динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты растворяют в 80см³ дистиллированной воды, значение рН доводят с помощью раствора соляной кислоты (с=4моль/дм³) до 7,0 и объем доводят до 100,0см³.

В фотометрической кювете должно находиться от 3 до 100мкг (измерение при 365) или от 2 до 50 мкг (измерение при 340,334нм) D-изолимонной кислоты. Для достижения необходимой разницы оптических плотностей, не менее 0,100ед., восстановленный сок разбавляют так, чтобы концентрация D-изолимонной кислоты лежала в интервале 0,2 – 1,0 г/дм³ или 0,1 – 0,5 г/дм³. Рабочий раствор для фотометрического определения получают в соответствии с таблицей 13, учитывая предполагаемую массовую концентрацию D-изолимонной кислоты.

Таблица 13 – Рабочие концентрации D-изолимонной кислоты

Предполагаемая концентрация ; L-яблочной кислоты в восстановленном соке, г/дм3		Разбавление водой	Фактор разбавления (F)
340 или 334 нм	365 нм
<0,5 0,5 – 5,0 50	<1,0 0,5 – 5,0 10,0	- 1 + 9 1 + 99	1 10 100

50 см³ исследуемого образца помещают в центрифужный стакан из кислотоустойчивого материала, добавляют 2,5см³ раствора гидрооксида натрия (с=4,0 моль/дм³), перемешивают и выдерживают в течение 10мин при комнатной температуре. Затем добавляют 2,5 см³ раствора соляной кислоты (с=4,0 моль/дм³) для нейтрализации щелочи, перемешивают. Последовательно, аккуратно перемешивая, приливают 1,0 см³ водного аммиака, 1,5 см³ раствора хлорида бария и 10,0 см³ ацетона, выдерживают в течение 10 мин. Полученную смесь центрифугируют в течение 5 мин. Надосадочную жидкость осторожно декантируют, осадок в стакане для центрифугирования растворяют в 10,0 см³ раствора сульфата натрия. Для ускорения растворения осадка стакан помещают в кипящую водяную баню и выдерживают в течение 10 мин при неоднократном перемешивании. После охлаждения до температуры 20 - 25°С раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25,0 см³ и доводят буферным раствором (TRIS-буфер с рН = 7,0) до метки. Содержимое мерной колбы переносят в коническую колбу, в которую предварительно вносят 0,5 г поливинилполипирролидона, смесь перемешивают, выдерживают в течение 5 мин и фильтруют через складчатый бумажный фильтр. Прозрачный фильтрат используют для ферментативного определения D-изолимонной кислоты.

Максимум поглощения НАДФН находится при длине волны 340 нм. При использовании спектрофотометра переменной длины волны все измерения проводят в максимуме поглощения НАДФН. При использовании спектрофотометра с ртутной лампой измерения проводят при длинах волн 334 или 365 нм. Используют стеклянную (пластиковую) кювету с толщиной оптического слоя 1 см. Определение проводят при температуре 20 - 25°С. Общий объем смеси в кювете составляет 3,050 см³ Оптическую плотность измеряют относительно воздуха. Дозирование реактивов в контрольную кювету и кювету с пробой осуществляют в соответствии с таблицей 14.

Таблица 14 - Дозирование реактивов

Реактивы, дозируемые в кювету	Обозначения кювет
	Контроль	Проба
Реактив 2	1,000см3	1,000см3
Раствор пробы	-	0,100см3
Дистиллированная вода	2,000 см3	1,900см3
Перемешивают, выдерживают в течение 3 мин, измеряют оптическую плот­ность растворов контроля и пробы Е1. Начинают реакцию с добавления
Реактив 3	0,050 см3	0,050 см3
Перемешивают, выдерживают в течение 10 мин, измеряют оптическую плот­ность растворов контроля и пробы Е2

Рассчитывают разность измеренных величин оптических плотностей (Е₂-Е₁) для контроля и пробы. Вычитая значение разницы оптических плотностей контроля из значения разницы оптических плотностей пробы, получают Е.

Е = (Е₂-Е₁)_пр – (Е₂-Е₁)_контр.

Если разница оптических плотностей значительно меньше 0,100 ед, то следует повторно приготовить пробу, уменьшив разбавление. При необходимости можно увеличить объем пробы, вносимой в спектрофотометрическую кювету, до 2,000 см³. При этом количество вносимой дистиллированной воды следует уменьшить так, чтобы общий объем раствора в кювете (V = 3,050см³) остался без изменений.

Массовую концентрацию D-изолимонной кислоты в восстановленном соке С, г/дм³, вычисляют по формуле:

,

где V - общий объем смеси в кювете;

М- молярная масса лимонной кислоты , М = 192,1 г/моль;

 - молярный коэффициент поглощения НАДН, равный

при 340 нм - 6,30 дм³  ммоль^-1  см^-1;

при 365 нм - 3,4 дм³  ммоль^-1  см^-1;

при 334 нм - 6,18 дм³  ммоль^-1  см^-1;

d-толщина поглощающего слоя в кювете (ширина грани), см;

v - объем пробы в кювете, см³;

Е - разница оптических плотностей;

F- фактор разбавления пробы в ходе подготовки к определению.

По результатам работы делают выводы

Лабораторная работа №7