0,04 Мкм, тобто значно менші, ніж під звичайним світловим мікроскопом. Тому

темнопольний мікроскоп часто називають ультрамікроскопом. Мікроскопію в тем-

ному полі зору використовують для дослідження рухливості бактерій, виявлення

збудників сифілісу, лептоспірозу, поворотного тифу. Але при цьому не можна доб-

ре вивчити внутрішню структуру мікроорганізмів. Для цієї мети запропоновані

видозмінені методи оптичної мікроскопії: фазово-контрастна, аноптральна та лю-

мінесцентна.

Фазово-контрастна мікроскопія – спосіб мікроскопічного дослідження про-

зорих, не поглинаючих світла об’єктів, який базується на підсиленні контрасту

зображення. Він полягає в тому, що живі клітини (бактерії), слабо поглинаючи

світло, все ж таки здатні змінювати фазу проникних променів. У різних ділянках

клітини товщина, щільність, а, отже, й показники заломлення світла будуть неод-

накові. Ці різниці у фазах ні орган зору, ні фотоплівка не помічають. Але їх можна

зробити видимими за допомогою спеціально-

го фазово-контрастного Я__ __Su____пристрою (рис. 2). Він

включає в себе конденсор з набором кільце-

вих діафрагм, які забезпечують освітлення

препарату повним конусом світла, та фазово-

контрастні об’єктиви. Вони відрізняються від

звичайних об’єктивів тим, що в їх головному

фокусі розташовується напівпрозора фазова

пластинка у вигляді кільця. Саме вона викли-

кає здвиг фази світла, що проходить через неї.

Це дозволяє зробити незабарвлені препарати

чітко видимими.

При роботі з фазово-контрастним при-

стрієм клітини можуть виглядати темними (по-

зитивний фазовий контраст) або світлими (не-

гативний контраст) у порівнянні з оточуючим

фоном. Цей вид мікроскопії не збільшує роз-

дільної здатності, але дозволяє виявити нові

деталі внутрішньої структури живих бактерій,

стадії їх розвитку, зміни під впливом антибіо-

Рис.2. Фазово-контрастний пристрій:

а – допоміжний мікроскоп; б – револь-

верний конденсор з діафрагмами;

в – спеціальні об’єктиви-ахромати.

а б

в

16 Частина І. Загальна мікробіологія

тиків та інших хіміопрепаратів. Він має й деякі недоліки: слабка контрастність

зображень, наявність сяючих ореолів навколо досліджуваних об’єктів. Значні пе-

реваги перед фазово-контрастним пристрієм має аноптральний мікроскоп.

Аноптральна мікроскопія – різновид фазово-контрастної, при якій викори-

стовують об’єктиви зі спеціальними пластинками, нанесеними на одну з лінз у

вигляді затемненого кільця кіптяви або міді. Це обумовлює поглинання близько

10 % світла, яке проходить через об’єктив і робить фон поля зору сіро-коричне-

вим. Широкий центральний отвір в шарові кіптяви чи міді випускає з об’єктиву

основну частину дифрагованого світла, у той час як темний шар кільця затримує

небажане периферійне дифраговане світло. За рахунок цього в значній мірі усу-

вається ореол навколо досліджуваних клітин.

Аноптральна мікроскопія успішно використовується при вивченні таких ма-

локонтрастних живих об’єктів як бактерії, гриби, найпростіші і навіть деякі віру-

си. При цьому досягається більша контрастність, роздільна здатність, стерео-

скопічність і чіткість зображення. Досліджувані мікроорганізми при цьому набу-

вають різних відтінків: від білого до золотаво-коричневого.

Інтерференційна мікроскопія базується приблизно на тих же принципах,

що й фазово-контрастна. Але на відміну від останньої вона дає можливість вивча-

ти деталі прозорих об’єктів і проводити їх кількісний аналіз. Це досягається зав-

дяки роздвоєнню світлового променя: один промінь проходить через частинку

об’єкта, а другий – поза нею. В окулярі обидва промені з’єднуються та інтерферу-

ють між собою. Різницю виникаючих фаз можна виміряти, визначаючи тим са-

мим масу різних структур у клітині. Так визначають товщину об’єкта, концентра-

цію в ньому сухої речовини, вміст води, що дає змогу зробити побічні висновки

про проникність мембран, активність ферментів, метаболізм клітин.

Інтерференційну мікроскопію використовують у цитологічних дослідженнях,

при кількісному аналізі клітинних структур живих об’єктів, наприклад, найпрос-

тіших, культур тканин тощо.

Люмінесцентна мікроскопія останнім часом широко використовується в

мікробіологічних дослідженнях. Цей метод дозволяє спостерігати первинну або

вторинну люмінесценцію (світіння) мікроорганізмів, клітин, тканин та окремих

їх структур. Зображення в люмінесцентному мікроскопі настає через світіння са-

мого препарату, яке виникає при освітленні його короткохвильовими променями.

Метод побудований на використанні явища флуоресценції. Оскільки більшість

хвороботворних мікробів не мають первинної (власної) люмінесценції, їх спочат-

ку обробляють слабкими розчинами спеціальних барвників (флуорохромів), які

зв’язуються певними структурами живих бактерій, не завдаючи їм шкоди. Найча-

стіше застосовують такі флуорохроми: акридиновий оранжевий, аурамін, кори-

фосфін, ізотіоціанат флуоресцеїну, трипафлавін та ін.

Промені світла від сильного джерела, наприклад, ртутної лампи надмірного

тиску, пропускають через синьо-фіолетовий світлофільтр. Під дією такого опромі-

нення забарвлені флуорохромом бактерії починають світитися червоним, зеленим,

жовтим або іншим світлом. Так, при забарвленні дифтерійних паличок корифос-

Розділ 2. Методи лабораторних досліджень 17

фіном вони набувають жовто-зеленого світіння, а при обробці аурамін-родаміном

збудник туберкульозу світиться золотаво-оранжевим кольором.

Метод люмінесцентної мікроскопії набагато чутливіший порівняно з іншими

мікроскопічними дослідженнями. Він дозволяє виявити таку малу кількість збуд-

ника, яку іншими методами не знаходять. За характером люмінесценції диферен-

ціюють окремі хімічні речовини, що входять до складу мікробних клітин. Вико-

ристання люмінесцентного мікроскопа має ряд переваг: кольорове зображення,

висока контрастність, можливість досліджувати як живі, так і вбиті мікроорганізми.

Люмінесцентну мікроскопію широко застосовують для виявлення антигенів

і антитіл (метод імунофлуоресценції). За її допомогою можна побачити мікроби,

які містять певні антигени. Для їх виявлення необхідно мати специфічні люмінес-

центні сироватки, які викликають флуоресценцію саме даного антигена. Цей ме-

тод успішно використовують для експрес-діагностики багатьох бактерійних і вірус-

них захворювань.

Окрім люмінесцентного пристрою ОІ-17 та спеціальних освітлювачів ОІ-18,

ОІ-28, ОСЛ-1, бактеріологічні лабораторії оснащені люмінесцентними мікроско-

пами МЛ-2, МЛД-1 та ін. Модель МЛ-2 має великий комплект оптики, фільтрів,

фотонасадку, дає змогу проводити одночасно комбіновані спостереження: люміне-

сцентне – при освітленні препарату зверху і фазово-контрастне – в проникному

світлі (рис. 3).

Електронна мікроскопія. Для вивчення будови мікроорганізмів на субклітин-

ному і молекулярному рівнях, а також для дослідження структури і архітектоніки

вірусів використовують електронний мікроскоп. Це високовольтний вакуумний

прилад, у якому збільшене зображення отримують за допомогою потоку елект-

ронів. Він має високу роздільну здатність і може давати збільшення від 20 тис. до