Складні методи забарвлення бактерій

Складні (диференціюючі) методи забарвлення базуються на фізико-хімічних

особливостях будови мікробних клітин. Суть їх полягає у фарбуванні мазка двома

барвниками, один з яких є основним, другий – доповнюючим (контрастним). Після

дії першого барвника мазок знебарвлюють кислотою, лугом, спиртом або ацето-

ном. Деякі мікроорганізми легко, інші важко знебарвлюються. Одні з них є кислото-

і спиртостійкими, другі тільки кислотостійкими. Спори бактерій дуже важко підда-

ються дії знебарвлюючих речовин, вони водночас є і фарбостійкими об’єктами.

Складні методи забарвлення вживають для детального вивчення структури

бактерійних клітин, а також для характеристики і диференціації одних мікроор-

ганізмів від інших. Отже, вони мають важливе діагностичне значення. У лабора-

торній практиці найчастіше використовують складні методи Грама, Ціля-Нільсе-

на, Нейссера, Буррі-Гінса та ін.

Забарвлення за Грамом

Цей метод розробив Кристіан Грам у 1884 р. Серед складних методів фарбу-

вання він є найбільш універсальним. Він має важливе диференціально-діагнос-

тичне значення, оскільки допомагає визначати таксономічне положення тих чи

інших бактерій.

Особливості забарвлення за методом Грама дозволяють поділити всі мікро-

організми на дві групи: грампозитивні та грамнегативні, хоча в практиці трапля-

ються випадки, коли одні й ті ж бактерії характеризують як грамваріабельні.

Принцип методу полягає в тому, що клітини грампозитивних мікробів здатні

утворювати міцну сполуку з генціанвіолетом та йодом, яка не вимивається з бак-

терій спиртом, отже, вони забарвлюються в темно-фіолетовий колір. У грамнега-

тивних бактерій цей комплекс вимивається спиртом, тому вони потім забарвлю-

ються фуксином у червоний колір.

До грампозитивних відносяться стафілококи, стрептококи, бацили, клостридії,

дифтерійні та туберкульозні палички. Грамнегативними є нейсерії (менінго- і го-

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів 33

нококи), кишкові палички, сальмонели, шигели, рикетсії, всі звивисті бактерії

(вібріони, спірили, спірохети, лептоспіри).

Механізм забарвлення за Грамом досить складний і ще остаточно не вивче-

ний. Грампозитивні бактерії мають товсту клітинну стінку, яка складається з 5-6

шарів пептидоглікану (муреїну) та полімерів тейхоєвих кислот. Ці структури лег-

ко сприймають і міцно утримують фарбуючий комплекс генціанвіолет + йод і при

дії спирту протягом 30-60 с не знебарвлюються. Грамнегативні бактерії мають

значно тоншу оболонку, що складається з 1-2 шарів петидоглікану, не містить тей-

хоєвих кислот, а, отже, не втримують комплекс основного барвника при знебарв-

ленні спиртом. При додатковій обробці мазка фуксином Пфейфера вони фарбу-

ються в червоний колір. Саме в цьому полягає основний механізм забарвлення за

методом Грама. Окрім того, різне забарвлення мікроорганізмів пов’язане з більш

високою концентрацією комплексу протеїн-рибонуклеїнату магнію в клітинах

грампозитивних бактерій, більш кислим значенням рH і різним співвідношенням

РНК:ДНК у цитоплазмі (у грампозитивних 8:1, а грамнегативних 1:1).

Виготовлення реактивів для забарвлення за Грамом. Найчастіше в лабораторії

готують такі барвники: 1) феноловий генціанвіолет, 2) розчин Люголя, 3) фуксин Пфейфе-

ра, 4) етанол 96°.

1. Феноловий генціанвіолет

Генціан фіолетовий 1 г

Фенол кристалічний 2 г

Етанол 96° 10 мл

Вода дистильована 100 мл

Феноловий генціанвіолет готують так само, як і феноловий фуксин Циля. Генціан

фіолетовий можна замінити кристалвіолетом, або водним розчином метилвіолету, який є

досить стійким. Його готують за таким прописом:

метиловий фіолетовий 0,2 г

вода дистильована 100 мл

2. Розчин Люголя

Йодид калію 2 г

Йод кристалічний 1 г

Вода дистильована 300 мл

Спочатку йодид калію розчиняють у невеликій кількості води, потім всипають крис-

талічний _________йод, після розчинення якого добавляють дистильовану воду до 300 мл.

3. Фуксин Пфейфера готують із концентрованого фенолового розчину цього барв-

ника, розводячи його в 10 разів дистильованою водою. Необхідно використовувати лише

свіжовиготовлений барвник.

Техніка забарвлення. Найбільш поширений, так званий стандартний спосіб

забарвлення за Грамом, проходить у декілька етапів:

1. На фіксований жаром мазок кладуть трохи коротшу і вужчу від предметно-

го скла смужку фільтрувального паперу. Зверху на неї наносять достатню кількість

34 Частина І. Загальна мікробіологія

розчину генціанвіолету (основний барвник) на 1-2 хв, зливають його і знімають

папірець.

2. Після прополоскування мазка водою наносять розчин Люголя на 1-2 хв (до

сильного потемніння препарату).

3. Зливають розчин Люголя і, не промиваючи мазок, знебарвлюють його 96°

етанолом протягом 30-60 с (до відходження сіро-фіолетових струмочків фарби).

4. Препарат ретельно промивають водою і додатково забарвлюють фуксином

Пфейфера (доповнюючий контрастний барвник) протягом 2 хв.

5. Мазок промивають водою, висушують, наносять краплю кедрової олії,

мікроскопують з імерсійним об’єктивом.

Мікроскопічна картина: при правильному забарвленні грампозитивні мікро-

організми фарбуються в темно-фіолетовий колір, грамнегативні бактерії, ткани-

ни, клітини органів – у рожевий (див. вкл., рис. 1).

Запропоновано ряд модифікацій цього методу, з яких найпоширенішим є ва-

ріант Синьова. Він полягає в тому, що замість розчину генціанвіолету (метилвіо-

лету, кристалвіолету) використовують смужки фільтрувального паперу заздалегідь

просочені одним із вказаних барвників і висушені. При забарвленні за Синьовим

на мазок наносять декілька крапель води, опускають і притискають пінцетом до

скла просочену фарбою смужку паперу. Через 2 хв її знімають. Наступні етапи

забарвлення такі самі, як і при стандартному методі Грама. Модифікація Синьова

особливо зручна для використання на практичних заняттях та в похідних лабора-

торіях. Вона дає значну економію барвника.

Забарвлення кислотостійких бактерій. Кислотостійкі мікроорганізми (збуд-

ники туберкульозу, прокази, актиноміцети та ін.) містять велику кількість високо-

молекулярних ліпідів, восків і міколової кислоти. Вони важко фарбуються зви-

чайними аніліновими барвниками. Але при забарвленні їх концентрованим фено-

ловим фуксином Циля з підігріванням міцно утримують його і не знебарвлюються

розчинами кислот, лугів і спиртів. Клітини тканин, лейкоцити, слиз, інші бактерії

при такій обробці легко віддають барвник. У зв’язку з цим при додатковому забарв-

ленні препаратів метиленовою синькою всі ці елементи після знебарвлення мазків

фарбуються в синій колір, а кислотостійкі бактерії залишаються червоними.

Метод Циля-Нільсена. Остаточний варіант методу автори запропонували в

1884 р. Техніка забарвлення включає декілька етапів:

1. На фіксований у полум’ї мазок із харкотиння хворого кладуть смужку

фільтрувального паперу, наливають на нього фуксин Циля і забарвлюють, тричі

підігріваючи до появи парів (але не доводячи до кипіння), після чого препарат із

фарбою залишають ще на 1-2 хв для охолодження; зливають барвник, знімають

папірець, промивають водою.

2. Препарат знебарвлюють 5 % сірчаною або соляною кислотою до появи

жовтуватого відтінку (10-30 с) і декілька разів промивають водою.

3. Додатково забарвлюють мазок метиленовою синькою Леффлера, промива-

ють водою, висушують і досліджують під мікроскопом.

Мікроскопічна картина: на загальному синьому (голубому) фоні кислотостійкі

бактерії виглядають рубіново-червоними (див. вкл., рис. 2).

Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів 35

Щоб відрізнити палички туберкульозу від збудника прокази використовують

метод Семеновича-Марциновського: спочатку мазок забарвлюють втричі розве-

деним фуксином Циля протягом 2 хв, промивають водою і додатково фарбують

метиленовим синім 5 хв. При цьому туберкульозні палички взагалі не сприйма-

ють забарвлення, а збудник прокази набуває червоного кольору.

При забарвленні кислотостійких бактерій замість класичного методу Циля-

Нільсена дуже зручно користуватися його модифікацією за Синьовим.

Фільтрувальний папір просочують концентрованим розчином фуксину Циля,

висушують, нарізають на смужки розміром з предметне скло і зберігають у

герметично закритій банці. На фіксований мазок наносять декілька крапель дис-

тильованої води, накладають зафарбовану смужку паперу, тричі нагрівають до

появи парів. Далі продовжують забарвлення так само, як і за оригінальним мето-

дом Циля-Нільсена.

Забарвлення за Романовським-Гімзою є одним із основних і найпоширені-

ших методів забарвлення мазків крові в гематології. За цим способом добре фар-

буються різні структурні елементи паразитів крові – малярійних плазмодіїв, три-

паносом, лейшманій. Його також часто застосовують для виявлення токсоплазм,

спірохет, рикетсій, личинок нематод тощо.

Поліхромний барвник Гімзи складається з азура, еозину й метиленового си-

нього. Краще вживати готовий його розчин фабричного виробництва. Безпосе-

редньо перед вживанням стандартний розчин розводять дистильованою водою

нейтральної або слабко лужної реакції (рН 7,0-7,2) із розрахунку 1-2 краплі барв-

ника на 1 мл води. Препарати-мазки фіксують метанолом протягом 3-5 хв і вису-

шують на повітрі. Приготований розчин наносять на мазок, а ще краще предметне

скельце з мазком опускають у склянку з барвником. Забарвлення триває від 30 хв

до двох і більше годин. Товсті краплі крові фарбують протягом 30 хв. Потім барвник

зливають, препарати промивають водою і добре висушують на повітрі у вертикаль-

ному положенні. Мікроскопію проводять із використанням імерсійних об’єктивів.

Будучи в розчині синьо-фіолетовим, поліхромний барвник Романовського-

Гімзи фарбує цитоплазму в голубий колір, а ядра клітин, тіла бактерій, їх капсули,

слиз – у червоно-фіолетовий. У дифтерійних паличок ядерні елементи забарвлю-

ються в темний червоно-фіолетовий колір, а волютинові зерна – у вишнево-черво-

ний; цитоплазма має рожевий колір.__