3.1 Ферменты микроорганизмов

Ферменты (лат. fermentare – бродить), или энзимы (греч. en – в, внутри, между + zymέ - закваска) – биологические катализаторы белковой природы, обладающие специфичностью и играющие важную роль в обмене веществ микроорганизмов.

Различаются ферменты однокомпонентные, представляющие собой простые белки (протеины) и двухкомпонентные, представляющие собой сложные белки (протеиды). Двухкомпонентные белки состоят из белковой части (апофермента) и небелковой части (кофактора). Небелковая часть имеет различную химическую природу – витамины, металлы, нуклеотиды и др. Большинство ферментов относится к двухкомпонентным.

Характерной особенностью ферментов является специфичность их действия – один и тот же фермент действует не только на определенное вещество. Специфические свойства фермента определяет белковая часть. Узнавание субстрата ферментом происходит в процессе связывания. Субстрат присоединяется в совершенно определенном участке молекулы фермента – каталитическом центре. Субстрат и фермент подходят друг к другу, как ключ к замку.

Небелковая группа определяет каталитическую активность. В качестве активной группы выступает либо коферменты, либо простетическая группа. Коферменты легко отделяются от белковой части и способны к самостоятельному существованию (это большинство витаминов или их производные). Простетическая группа прочно связана с белковой частью и не отделяется от нее. Например, содержащий железо гем у ферментов цитохромной системы. Апофермент усиливает каталитическую активность кофакторов.

В настоящее время известно более 2000 ферментов. По типу катализируемой реакции ферменты классифицируют на 6 классов. В клетках микроорганизмов обнаружены ферменты всех классов. Название многих ферментов образуется путем добавления окончания "аза" к названию субстрата, на который воздействует данный фермент.

Оксидоредуктазы. Эти ферменты катализируют окислительно-восстановительные процессы, к ним относятся дегидрогеназы, цитохромы, оксидазы, пероксидаза, каталаза.

Дегидрогеназы катализируют реакции отрыва водорода от молекулы субстрата (окисление) и перенос его на другое вещество (восстановление). Дегидрогеназы могут содержать в качестве активны группировок пиридиновые и флавиновые производные. Первичные (анаэробные) дегидрогеназы содержат в качестве коферментов пиридиновые производные (НАД – никотинамидадениндинуклеотид, НАДФ). Они передают оторванный от субстрата водород не на кислород, а на другие ферменты или переносчики. Вторичные (аэробные) дегидрогеназы содержат в качестве активных группировок флавиновые производные (ФАД – флавинадениндинуклеотид, ФМН - флавинаденинмононуклеотид), Они переносят водород от субстратов или пиридиновых дегидрогеназ непосредственно на молекулярный кислород или к цитохромам.

Цитохромы содержат атомы железа и обеспечивают протекание окислительно-восстановительных реакций в результате перехода железа из двухвалентного состояния в трехвалентное, т.н.являются переносчиками электронов. Непосредственно от цитохрома к кислороду передает электроны цитохромоксидаза. Цитохромы широко распространены в микробных клетках. Они могут переносить электроны не только на молекулярный кислород, но и на другие акцепторы электронов.

В случае, когда водород от окисляемого субстрата непосредственно передается на молекулярный кислород, в клетке образуется пероксид водорода. Нейтрализацию этого ядовитого соединения в клетках аэробных микроорганизмов осуществляют ферменты каталаза и пероксидаза. Каталаза катализирует расщепление пероксида водорода до воды и молекулярного кислорода. Пероксидаза катализирует также окисление пероксидом водорода органических веществ клетки. В обоих случаях происходит расщепление перекиси водорода.

Трансферазы. В эту группу объединены ферменты, катализирующие перенос группировок с одной молекулы на другую. Гексокиназы переносят фосфорные группировки, что обеспечивает фосфорилирование сахаров – пусковые реакции утилизации углеводов. Трансаминазы катализируют реакции переноса аминогрупп от аминокислот к кетокислотам, обеспечивая синтез необходимых клетке аминокислот. Исключительно важную роль в процессах переноса играет кофермент А. Назван он так потому, что впервые был идентифицирован как переносчик ацильного (уксусного) радикала СН₃СО^-. Известно, что большая часть углеродных атомов углеводов, жирных кислот и аминокислот подвергается превращениям с помощью кофермента А. Активной группой кофермента А является конечная тиоловая группа –SH тиоэтаноламина. Поэтому обычно этот кофермент обозначается КоА-SH. Благодаря наличию конечных тиоловых групп кофермент А может вступать в реакцию с конечными карбоксильными группами органических кислот:

СН₃СООН + КоА-SH → СН₃СО – S – КоА + Н₂О

Гидролазы. Ферменты этого класса обеспечивают расщепление сложных соединений с одновременным присоединением воды. В зависимости от того, какие связи при этом разрываются, гидролазы делятся на подклассы. Пептидгидролазы – многочисленные протеолитические ферменты, обеспечивающие разложение микроорганизмами белков различного происхождения. Эстеразы – гидролазы, разрушающие сложноэфирные связи. Сюда входят липазы, катализирующие гидролиз жиров до глицерина и жирных кислот, пектинэстеразы, катализирующие расщепление пектиновых субстратов. Гидролиз полисахаридов осуществляют в основном амилазы и целлюлазы. Благодаря их активности расщепляются такие соединения, как крахмал и целлюлоза.

Лиазы. Эти ферменты катализируют негидролитическое отщепление атомных группировок с образованием двойных связей или присоединение группировок по месту этих двойных связей (действуют на связи С=С, С=N, С=О и т.п.). Катализируют отщепление различных групп – СО₂, HN₃ и др. У микроорганизмов активны декарбоксилазы, отщепляющие карбоксильную группу от аминокислот. Эти ферменты характерны для гнилостных микроорганизмов. В углеводном обмене важную роль играет альдолаза, обеспечивающая центральную реакцию превращения углеводов – расщепление гексозы на две триозы.

Изомеразы. Эти ферменты катализируют внутримолекулярные превращения, например, превращения одного изомера в другой. Триозофосфатизомераза обеспечивает взаимопревращения триоз, образующиеся при расщеплении гексоз. Галактозофосфатизомераза катализирует превращение галактозы в глюкозу.

Лигазы (синтетазы). Они обеспечивают реакции синтеза, сопровождаемые отщеплением остатков фосфорной кислоты от трифосфатов, например, АТФ. Благодаря этим ферментам синтезируются аминокислоты, ацетил-КоА, происходит карбоксилирование органических кислот.

Ферменты локализуются в микробной клетке в различных структурных элементах (рибосомах, мезосомах, ЦПМ и др.), действие их происходит строго согласованно. В микробной клетке ферменты могут функционировать независимо друг от друга или же могут структурно объединяться в полиферментные комплексы. В этих комплексах ферменты тесно связаны друг с другом и вне его теряют значительную часть своей активности.

Конститутивные ферменты с постоянной скоростью синтезируются в клетке независимо от наличия в среде субстрата, на который распространяется их действие. Таким ферментам принадлежит основная роль в клеточном обмене. Индуцибельные (адаптивные) ферменты – это такие, которые активно синтезируются только в том случае, когда имеется субстрат, превращение которого они катализирую.

По действию ферменты подразделяются на эндо- и экзоферменты. Эндоферменты прочно связаны с клеточными структурами и функционируют только внутри клетки. Они катализируют реакции биосинтеза и энергетического обмена. Большинство ферментов являются эндоферментами. Эти ферменты и после гибели микробной клетки временно остаются в активном состоянии. В результате их действия происходит самопереваривание, или автолиз клетки. При разрушении клетки ферменты поступают в окружающую среду.

Экзоферменты свободно выделяются в окружающую среду. К ним относятся ферменты, катализирующие расщепление сложных органических веществ на более простые. Таим образом обеспечивается внеклеточное переваривание, т.е. превращение экзогенного субстрата в усвояемую форму. Кроме того, экзоферменты могут быть средством, с помощью которого микроб-паразит внедряется в тело хозяина; могут иметь защитное значение, инактивируя в среде вредные для клетки вещества.

Активность ферментов. Ферменты обладают высокой активностью. Ничтожные количества фермента обеспечивают значительную скорость реакции и вызывают превращения больших количеств реагирующих веществ.

Белковая природа ферментов обуславливает их лабильность – потерю активности под влиянием некоторых факторов, важнейшими из которых являются температура и реакция среды. Максимальная активность достигается в области оптимальной для микроорганизма температуры, после сего начинается падение активности, связанное с денатурацией белковой части фермента. Почти все ферменты необратимо разрушаются при 80⁰С. В условиях близких к 0⁰С и ниже ферментативная активность замедляется и в большинстве случаев приостанавливается.

Большинство ферментов имеют максимальную активность в нейтральной среде, но для некоторых оптимум рН может находиться в кислой или щелочной области значений. Лучистая энергия разрушает ферменты. На активность ферментов влияет присутствие в среде различных химических соединений. Одни из них повышают активность ферментов (активаторы), другие – снижают (ингибиторы). Активаторами выступают витамины, двухвалентные катионы, ингибиторами – соли тяжелых металлов, антибиотики.

Различают обратимое и необратимое ингибирование. При необратимом ингибировании фермент полностью или частично теряет активность в результате необратимого разрушения или модификации его функциональных групп.

Обратимое ингибирование может быть конкурентным и неконкурентным. При конкурентном ингибировании ингибитор по структуре молекулы напоминает субстрат и может взаимодействовать с активным центром фермента, т.е. конкурировать за него с субстратом. В основе неконкурентного ингибирования лежит способность ингибитора взаимодействовать с какой-либо группой молекулы субстрата, существенно влияющей на его активность, но не входящей в активный центр.

Возможно также субстратное ингибирование, наблюдаемое при избыточной концентрации субстрата. В этом случае в результате реакции фермента одновременно с двумя молекулами субстрата образуется неактивный фермент-субстрат-ный комплекс. Ингибирование конечным продуктом осуществляется регуляторным механизмом клетки по типу обратной связи. Это заключается в подавлении синтеза ферментов, катализирующих реакцию, продукт которой оказывается в клетке в избытке.

Кинетика ферментативных реакций. Основным уравнением стационарной кинетики ферментативных реакций является уравнение Михаэлиса-Ментен:

v = (K₊₂ ∙ [E_о] ∙ [S] ) / (K_m + [S] ) , (3.1)

где v – скорость реакции;

E_о – общая концентрация фермента в системе;

S - концентрация субстрата;

K_m = (K_-1 + K₊₂) / K₊₁ , (3.2)

где K_m – константа Михаэлиса-Ментен;

K₊₁ и K_-1 - константы скоростей прямой реакции образования ферментно-субстратного комплекса ЕS и обратной реакции его диссоциации;

K₊₂ – константа скорости образования конечного продукта.

Максимальная скорость реакции достигается при такой концентрации субстрата, когда весь фермент связан в ферментно-субстратный комплекс.