3. Характерные особенности метаболонов.

• В структурной и функциональной иерархии биологических систем метаболон относится к уровню надмолекулярных структур, который расположен между уровнями биомакромолекул и клеточных органоидов.

• Функция метаболона состоит в реализации определенного метаболического процесса, состоящего из совокупности метаболических реакций. Такие совокупности принято называть метаболическими системами. Таким образом, метаболон – это структура, объединяющая ферменты метаболической системы.

• Метаболоны ассоциированы с клеточными структурами. Якорные белки, ответственные за ассоциацию метаболона со структурой сами могут входить в состав метаболона.

Билет 10.

1. Основные этапы и направления развития энзимологии.

• Ферментативная кинетика (создание моделей, изучение сложных ферментативных реакций)

• Медицинская энзимология (изучение наследственных и приобретенных энзимопатий, энзимодиагностика, энзимотерапия, ингибиторы ферментов как лекарственные препараты)

• Инженерная энзимология (иммобилизованные ферменты, промышленное применение, конструтрование ферментов с заданными свойствами, ферменты как аналитические реагенты)

• Структурная – включает элементы белковой химии (Выделение, очистка, изучение трехмерной структуры, конформационных перестроек , ингибиторов, регуляторных свойств, картирование активного центра, расшифровка механизма катализа реакций)

2. Ингибирование субстратом. Виды субстратного ингибирования.

В случае некоторых ферментов к фермент-субстратному комплексу ES присоединяется вторая молекула субстрата, в результате чего образуется неактивный комплекс SES. Схема такой реакции имеет следующий вид: E + S  ES (+S)  SES, ОТ ES К E ИДЕТ двойная стрелка с образованием продукта.

Она аналогична схеме бесконкурентного ингибирования и дает следующее уравнение для начальной скорости:

V = K+2E0S/(((K-1 + K+2)/K+1) + S (1+S/Ksi)) = Vs/ (Km + S + S²/Ksi).

Если концентрация субстрата поддерживается равными или ниже предполагаемых концентраций его в физиол условиях, субстратное ингибир обычно не играет существенной роли. Но при высоких конц-х субстрата оно может стать весьма значительным.

3. Примеры некаталитических свойств фермента.

Билет 11.

1. Термодинамический принцип ферментативного катализа. Энергия активации. Зависимость скорости реакции от температуры. Причина существования температурного оптимума.

Законы термодинамики выполняются и в ферментативном катализе: ΔG=ΔH – TΔS.

ΔG

Активационный барьер

Энергия активации некатализируемой реакции

Исходное состояние

Полное ΔG

Конечное состояние

Свободная энергия связывания используется на снижение активационного барьера.

E+S -> ES -> EX (переходное состояние, запускающее реакцию) -> EP -> E+P

ΔG’⁰= -RT ln k’_eq – константа равновесия

E+S -> ES, v=k1E*S

ES-> E+S, V=K2es

ES-> E+P, v= K3ES

• Ферменты ускоряют реакцию, понижая энергию активации реакции за счет снижения энергии переходного состояния.

• Ферменты не сдвигают равновесие реакции, ускоряя реакцию как в прямом так и в обратном направлениях одинаково.

• Ферменты не изменяют термодинамических характеристик, в частности ΔG, изменение свободной энергии Гиббса.

• Ферменты влияют на кинетические, но не термодинамические характеристики реакции.

• Взаимодействие фермента и субстрата происходит а активном центре.

2. Понятие «обобщенного» основания и «обобщенной» кислоты при кислотно-основном катализе. Примеры.

С точки зрения обобщенной теории кислот и оснований Льюиса — Бренстеда — Усановича кислотой является всякое вещество, способное отдавать катионы и присоединять электроны или анионы, а основанием — любое вещество, способнее отдавать электроны или анионы и присоединять катионы.

3. Типы «moonlighting» ферментов.

• активности представлены разными частями молекулы. Избыточная часть формирует новый центр. Например, I-Anil матураза проявляет активность при сплайсинге РНК и ДНКазную активность. При замене аргинина белок теряет способность участвовать в сплайсинге. Активность ДНКазная не нарушается. Две активности разделены пространственно и расположены на противоположных поверхностях молекулы.

• Белки с «неупорядочной» структурой, способные принимать разные конформации и взаимодействовать с разными партнерами.

Билет 12.

1. Применение методов графов для вывода уравнений скорости сложных ферментативных реакций (на примере креатинкиназы).

R RS

T TS

Фермент может существовать в различных конформационных состояниях. Субстрат может присоединяться к любому состоянию. Образование продукта может происходить, если фермент в состоянии Т.

Вводим понятие «древо» - путь, который охватывает все вершины без образования цикла. Для того, чтобы найти скорость реакции этого комплекса, нужно построить деревья, которые ведут в эту точку. Числитель – сумма путей в эту точку. Знаменатель – сумма всех путей.

Далее см. презентацию по ферментативной кинетике.

2. Единицы активности ферментов. (см выше)

3. Модели взаимодействия ферментов и субстратов.

В модели "ключ-замок" Фишера подразумевается полная комплементарность субстрата и фермента. При этом Е напряжения=0 и катализ имеет энтропийный характер: субстрат в комплексе принимает одну из возможных конфигураций, благоприятную для последующей реакции. Аллостерические ферменты этой моделью не описываются.

Кошланд предложил модификацию модели «ключ-замок», учитывающую гибкость структуры молекулы фермента и получившую название модели индуцированного соответствия (иногда эту модель называют также "рука - перчатка" ). В этой модели считают фермент достаточно эластичным, активный центр фермента может изменить конформацию после связывания субстрата, что обеспечивает полную комплементарность в результате чего боковые группы аминокислот активного центра принимают положение, позволяющее ферменту выполнить свою каталитическую функцию. При этом Енапряжения=0 и катализ имеет энтропийный характер. Модель может описывать аллостерические эффекты за счёт изменения конформации фермента. Связывание субстрата с ферментом может стабилизировать различные конформации как субстрата, так и фермента и ориентировать каталитические группы фермента для облегчения более прочного связывания переходного состояния и /или вытеснения воды. В отличие от модели «ключ-замок», модель индуцированного соответствия объясняет не только специфичность ферментов, но и стабилизацию переходного состояния, более сильное связывание ферментом переходного состояния, а не субстратов. Классический пример модели индуцированного соответствия Кошланда: Конформационные изменения индуцированные связыванием глюкозы гексокиназой - энергия связывания глюкозы (но не H2O) и другого субстрата, Mg2+•ATP индуцирует конформационные перестройку в активную форму, когда каталитические аминокислотные остатки правильно ориентированы для обеспечения перенос фосфорильной группы от АТФ к глюкозе.

Модель напряжений (Ламри, Эйринг, Дженкс): силы сорбции используются для создания напряжений в молекулах реагентов. Если же АЦ жесткий, то субстрат должен претерпеть некоторую деформацию.

В модели "дыбы" предполагают неполную комплементарность субстрата и фермента, причем структура фермента абсолютно жесткая, молекула субстрата также меняет конформацию после связывания в активном центре, при образовании фермент-субстратного комплекса субстрат напрягается так, что энергия напряжения Ен>0 сосредоточена на атакуемой связи. Катализ имеет как энтропийный, так и энтальпийный характер.

В модели взаимоиндуцированного соответствия в комплексе напряжены как субстрат, так и фермент. Модель "дыбы" и модель Кошланда являются частными случаями модели взаимоиндуцированного соответствия, когда жёсткость фермента много больше жёсткости субстрата (дыба) или наоборот (модель Кошланда).

Термодинамическая же сущность всех этих теорий одна: потенциальная свободная энергия связывания (сорбции) субстрата на ферменте тратится на понижение барьера свободной энергии активации последующей химической реакции.

Билет 14.

1. рН-зависимость ферментативной реакции.

Активность ферментов зависит от рН раствора, в котором протекает ферментативная реакция. Для каждого фермента существует значение рН, при котором наблюдается его максимальная активность. Отклонение от оптимального значения рН приводит к понижению ферментативной активности.

Влияние рН на активность ферментов связано с ионизацией функциональных групп аминокислотных остатков данного белка, обеспечивающих оптимальную конформацию активного центра фермента. При изменении рН от оптимальных значений происходит изменение ионизации функциональных групп молекулы белка. Например, при закислении среды происходит протонирование свободных аминогрупп (NH₃⁺), а при защелачивании происходит отщепление протона от карбоксильных групп (СОО^-). Это приводит к изменению конформации молекулы фермента и конформации активного центра; следовательно, нарушается присоединение субстрата, кофакторов и коферментов к активному центру. Кроме того, рН среды может влиять на степень ионизации или пространственную организацию субстрата, что также влияет на сродство субстрата к активному центру. При значительном отклонении от оптимального значения рН может происходить денатурация белковой молекулы с полной потерей ферментативной активности.

2. Уравнение М-М. Условия его применимости. (см выше)

3. Классификация олигомерных ферментов. Аллостерические ферменты. Кооперативность.

Аллостерическим механизмом регуляции активности ферментов называют регуляторный механизм, в котором контроль активности фермента реализуется путем изменения конформации белковой молекулы, индуцируемого связыванием метаболита-регулятора в особом (аллостерическом) центре, пространственно удаленном от активного центра. Изменение конформации молекулы фермента влечет за собой изменение каталитических характеристик активного центра. Метаболит-регулятор, модифицирующий активность фермента подобным образом, называют аллостерическим эффектором. Олигомерная молекула фермента, состоящая из нескольких субъединиц, может содержать несколько активных центров и несколько аллостерических центров для определенного эффектора. В таком олигомере возможны взаимодействия не только между активным и аллостерическим центрами, но и между центрами одного сорта (между активными или между аллостерическими центрами). В результате взаимодействия между субъединицами связывание субстрата становится кооперативным, и кривая зависимости скорости реакции v от концентрации субстрата [S] приобретает сигмоидную форму. Обычно эти ферменты ответственны за регуляцию и контроль метаболических процессов, и их активность регулируется по принципу обратной связи.