1. Колориметрические методы контроля ферментативной реакции. Примеры.

Первая группа методов основана на взаимодействии белка с ионами меди в щелочной среде. К ним относятся несколько методов, в которых используется биуретовый реактив в вариантах для концентрированных белковых растворов и более разбавленных, а также несколько разновидностей метода Лоури. Колориметрические методы этой группы принято считать наиболее корректными, потому что концентрация окрашенных комплексов и, соответственно, интенсивность окраски пропорциональны числу пептидных связей. Окраска белкового комплекса обычно стабильна в течение длительного времени (около часа).

Вторую группу колорим методов составляют методы, основанные на взаимодействии положительно заряженных амко белков с разнообразными по химической структуре кислыми красителями.

В отличие от спектрофо-х колориме-е методы требуют более значительных затрат времени, так как образование цветных комплексов белка с теми или иными реактивами не происходит мгновенно, в процессе проведения анализа происходит деструкция исследуемого белка, поскольку красители образуют с белками прочные связи. В то же время объем пробы, необходимый для проведения анализа, как правило, невелик. В целом эти методы обладают большей чувствительностью и помехоустойчивостью вследствие того, что при взаимодействии красителей с белками образуются специфические комплексы с очень интенсивным окрашиванием.

В большинстве таких методов для получения количественной оценки результата необходимо построение калибровочного графика или применение вычислительной техники. В идеальном варианте в качестве стандарта для построения калибровочного графика используют раствор исследуемого белка или раствор смеси белков, идентичный по составу анализируемому образцу. При невозможности выполнить это требование, большинство исследователей строят калибровочные графики, используя в качестве стандарта БСА.

2. Механизмы ферментативного катализа. (см выше)

3. Полуцентровая реактивность олигомерных ферментов.

Билет 16.

1. Принципы классификации ферментов.

2. Линеаризация уравнения М-М.

3. Наблюдение за ходом креатинкиназной реакции с помощью сопряженной системы Росалки.

Билет 17.

1. Механизмы двусубстратных реакций. (см выше)

2. Классификация трансфераз.

Катализируют перенос функциональных групп от одного соединения к другому. Подразделяют в зависимости от переносимой группы. Систематическое название составляется по форме «донор: транспортируемая группа – трансфераза». Например, для мевалонаткиназы -ATP:мевалонат 5- фосфотрансфераза. К классу трансфераз относят аминотрансферазы, ацилтрансферазы, метилтранс-феразы, гликозилтрансферазы, киназы (фосфо-трансферазы).

В настоящее время представленные в белковых базах данных киназы разбиты на 25 семейств гомологичных киназ, которые сгруппированы в 12 суперсемейств (групп), отличающихся по типу фолдинга белковой молекулы. В белковых базах данных в основе структурной классификации на суперсемейства киназ, имеющих глициновые петли для связывание нуклеотидов, лежат особенности структуры мотивов фланкирующих остатки глицина и расположение консенсусных мотивов внутри белковой молекулы. Одной из наиболее многочисленных групп являются суперсемейства киназ (и других нуклеотидсвязывающих белков), построенных на основе α β сандвича в различных модификациях, первоначально обнаруженный Россманом как специфический тип фолдинга для динуклеотидсвязывающих белков. Содержащие характерные остатки глицина в петлевых структурах были обнаружены у ряда киназ, в частности, в так называемом семействе классических P-loop (содержащих фосфатные петли) киназ, по фолдингу отнесенных к группе Россман-подобных киназ.

Согласно международной классификации и номенклатуре ферментов трансферазы относятся ко 2 классу, в пределах которого выделяют девять подклассов.