3. Понятие «moonlighting» ферментов.

Сначала можно рассказать про метаболон всё, что в голову придёт, ну или что в презентации написано.

Такое явление, когда белки выполняют разные и не связанные между собой функции обозначают английским термином "functional moonlighting" (moonlighting - подрабатывать на стороне). Исследователи обнаружили, что транспорт тРНК лизина в митохондрии происходит с участием энолазы Eno2p, фермента гликолиза, катализирующего образование фосфоенолпирувата из 2-фосфоглицерата. При этом роль энолазы, по-видимому, состоит в подготовке тРНК к связыванию с preMsk1p - белком, переносящим тРНК лизина в митохондрию и синтезирующем лизил-тРНК. Таким образом, энолаза может быть РНК-шапероном для тРНК лизина.

Билет 3.

1. Механизмы двусубстратных реакций и пути их определения.

Существует 2 типа механизмов:

1. последовательное присоединение субстратов (<=> - обозначаем обратимую реакцию): Е <=> ЕА <=>ЕАВ -> Е + Р (над стрелочками k_a, k_B, k³)

2. «пинг-понг» = с ковалентными субстратами:

3. МОЖЕТ быть неупорядоченный тип присоединения

2. Структурные особенности активного фермента.

Амк, составляющие АЦ фермента, отстоят далеко друг от друга при рассмотрении первичной структуры. Например, АЦ трипсина составляют сер195, гис57, асп102. Расстояние между гис и асп изменяется, гис становится сильным нуклеофилом. Гис отнимает протон у сер, а сер может атаковать С=О пептидной связи. АЦ представляет собой центр связывания и каталитический центр. Каталит центр (КЦ) представлен карманом = каталитической щелью, расположенной в междоменном пространстве. При связывании субстрат теряет гидратную оболочку. АЦ фермента комплементарен не субстрату, а переходному состоянию.

3. Спектрофотометрический метод наблюдения за ферментативной реакцией.

В основе спектрофотометрических методов определения количества белка и пептидов лежит способность отдельных хим групп, входящих в их структуру, поглощать лучи света прежде всего в уф области спектра.

Любая молекула поглощает свет в широком диапазоне длин волн, однако при данной длине волны в спектре обычно преодладает поглощение хим групп определённого типа, кот называются хромофорами. Хромофоры белков поглощают свет при длине волны менее 300нм.

Хромофоры белков: хром-ры пептидной связи, амк остатков (трпф, тир, фенал), простетических групп для сложных белков (гемоглобин, миелопероксидаза и т.д.)

В спектре большинства природных пептидов есть, как минимум, два пика поглощения. Сильное поглощение в диапазоне длин волн 190-230 нм вызвано возбуждением р-электронов азота, углерода и кислорода пептидной группы. В интервале 230-300нм лежат полосы поглощения имидазольного кольца гис и дисульф связи цистеина, но интенсивность этого поглощения невелика по сравнению с интенсивностью поглощ тир, фенил, триптофана. Интенсивность первой полосы всегда выше второй.

Зная примерное содержание ароматических амко в белке или используя найденные по спектрам стандартных белков соотв коэффициенты, возможно создать формулы для расчета концентрации белковых растворов по известной величине поглощения в УФ области спектра.

Спектрофотометрич методы опред кол-ва белка позволяют анализировать образец, не подвергая его разрушению и без преинкубации с какими-либо реактивами, что существенно упрощает процедуру анализа. Эти методы обладают относительно небольшой чувствительностью и невысокой точностью. Для этих методов желательно использовать нейтральные буферные растворы.

Результаты измерений выражают десятичным логарифмом отношения интенсивности падающего света и прошедшего через поглощающий раствор потока света. Если пренебречь эффектами отражения и рассеяния, то эта величина фактически характеризует собой поглощение А, которое, согласно закону Б-Л-Б, пропорционально концентрации поглощающего света С, толщине слоя d и молярному коэффициенту поглощения ɛ.

Для применения этого соотношения обычно строят калибровочн график, используя для этого несколько различных концентраций какого-либо белка, принимаемого за стандарт. Концентрацию исследуемого раствора можно определить по графику.

Билет 4.