1. Принципы классификации лиаз. Примеры лиазных реакций. Механизм альдолазной реакции.

К лиазам относят ферменты, отщепляющие от субстратов негидролитическим путём определённую группу (при этом могут отщепляться СО2, Н2О, NH2,SН2и др.) или присоединяющие чаще всего молекулу воды по двойной связи. Наименование составляют по форме «субстрат-лиаза». Однако чаще в названии учитывают подкласс фермента. Лиазы отличаются от других ферментов тем, что в катализируемых реакциях в одном направлении участвуют два субстрата, а в обратной реакции только один. В названии фермента присутствуют слова "декарбоксилаза" и "альдолаза" или "лиаза" (пируват-декарбоксилаза, оксалат-декарбоксилаза, оксалоацетат-декарбоксилаза, треонин-альдолаза, фенилсерин-альдолаза, изоцитрат-лиаза, аланин-лиаза, АТФ-цитрат-лиаза и др.), а для ферментов, катализирующих реакции отщепления воды от субстрата - "дегидратаза" (карбонат-дегидратаза, цитрат-дегидратаза, серин-дегидратаза и др.). В тех случаях, когда обнаружена только обратная реакция, или это направление в реакциях более существенно, в названии ферментов пристутствует слово "синтаза" (малат-синтаза, 2-изопропилмалат-синтаза, цитрат-синтаза, гидроксиметилглутарил-CoA-синтаза и др.).

По международной классификации и номенклатуре ферментов лиазы принадлежат к 4 классу, в пределах которого выделяют семь подклассов:

• КФ 4.1 включает ферменты, которые расщепляют углерод-углеродные связи, например, декарбоксилазы (карбокси-лиазы);

• КФ 4.2 — ферменты, расщепляющие углерод-кислородные связи, например, дегидратазы;

• КФ 4.3 — ферменты, расщепляющие углерод-азотные связи (амидин-лиазы);

• КФ 4.4 — ферменты, расщепляющие углерод-серные связи;

• КФ 4.5 — включает ферменты, расщепляющие связи углерод — галоген, например, ДДТ-дегидрохлориназа;

• КФ 4.6 — ферменты, расщепляющие фосфор-кислородные связи, например, аденилатциклаза;

• КФ 4.99 — включает другие лиазы.

Механизм альдолазной реакции: помимо альдольного расщепления ФДФ альдолаза катализирует стереоспецифический обмен водорода между ДОАФ и водной средой. Эта реакция является обязательным этапом перед конденсацией, здесь образуется ФС комплекс. В механизме альдолазной реакции различают С-С расщепление и С-Н связеобразование.

2. Обзор методов наблюдения за ферментативной реакцией. Требования к проведению кинетических экспериментов.

Наблюдение (эпизодическое или непрерывное) за расходом субстрата или накоплением продукта реакции

Методы:

• Прямые (СФ, флюориметрические, рН-метрические, потенциометрические, титриметрические …)

• косвенные(колориметрические, хроматографические …)

Условия: pH-статирование, термостатирование, контроль объема, перемешивание …

Метод	Плюсы и описание	Недостатки
Спектрофотометрия	почти линейная связь между концентрацией реагента и величиной сигнала можно исп-ть приборы с термостатируемыми кюветами и связью с ПК	Не всегда в ходе реакции заметно меняются оптическиеарактеристики!
Флюориметрия, люминометрия	Высокая чувствительность методов	Неуниверсальность, ограничения в применении
Титриметрия	Образование или расход H+ в ходе реакции. Автотитратор (pH-метр, соединенный с автоматической бюреткой; запись расхода титранта на бумаге или в ПК; возможность термостатирования)	Постоянное разбавление реакционной смеси, изменение объема (которое можно и необходимо учитывать) и концентрации реагентов
Колориметрические методы	Взаимодействие продукта реакции с красящим реагентом и образование окрашенного соединения Примеры: метод Фолина-Чокалтеу;окрашивание свободных аминогрупп ТНБС; биуретовый метод; метод Эннора-Розенберга (окрашивание креатина a-нафтолом и диацетилом)	Не позволяет непрерывно следить за реакцией
Хроматографические методы		Значительный расход времени на каждую пробу