Принципы взаимного расположения ферментов в метаболоне:

• Ферменты, которые катализируют реакции, следующие одна за другой в метаболическом пути, должны занимать соседние позиции в комплексе.

• Ферменты, использующие и регенерирующие NAD, ATP, CoA и другие коферменты, должны находиться в контакте друг с другом. В ряде случаев целесообразно, чтобы все ферменты, использующие один кофермент, были расположены рядом.

• Ферменты, активность которых регулируется интермедиатами данной метаболической системы, должны располагаться в метаболоне таким образом, чтобы обеспечить возможность реализации этого регуляторного механизма.

Билет 5.

1. Теория переходного состояния.

АЦ фермента комплементарен не субстрату, а переходному состоянию. Ингибитор комплементарен исходному состоянию. Переходное состояние стабилизируется слабыми взаимодействиями. Многообразие слабых взаимод-й АЦ фермента и субстрата в переходном состоянии приводит к высвобождению свободной энергии, называемой энергией связывания.

Условия для достижения переходного состояния: ΔG=ΔH - TΔS

• Большое ΔH – необходимо сильное растяжение или разрыв хим связей.

• Большое ΔS – необходима строго определенная коформация и взаимная ориентация реагирующих молекул.

Ускорение реакции зависит величины ΔΔG, т.е. от силы связывания ферментом именно переходного состояния: эффективность катализа связана с тем, что оно связывается сильнее, чем и начальный субстрат, и конечный продукт. Для превращения субстрата в продукт необходимо, чтобы молекула субстрата преодолела определённый энергетический барьер (энергия активации). Фермент снижает энергию активации, потому что стабилизирует переходное состояние.когда молекула находится в переходном состоянии, вероятность превращения ее в продукты реакции равна вероятности возврата ее в исходное состояние.

2. Уравнение М-М. Условия его применимости.

Скорость ферментативной реакции.

E+S ES -> E+P (над первой стрелочкой k₁, под ней k _-1, над второй стрелкой k₂).

Предположение 1: химическое превращение комплекса ES медленнее, чем стадия образования ES.

Предположение 2: к2>>к-1, что делает первую стадию образования комплекса необратимой.

Предположение 3: концентрация ES не меняется. Это общее допущение стационарности Бриггса и Холдейна.

[E₀]=[Eсвоб]+[ES]

Скорость образования продукта по закону химической кинетики = константе на концентрацию из чего образуется.

Vрасп = k₂*[ES], Vобраз = k₁* [E][S]

k₁* [E][S] = k₂*[ES] + k _-1*[ES]

k₁* [E0 - ES] * [S] = k₂*[ES] + k _-1*[ES]

SK1E0 – K1ES*S = ESK2 + K-1 ES

SK1E0 = ESK2 + K-1 ES + K1 ES*S

SK1E0 = (K2+K-1 + K1S)* ES

ES = ДЕЛИМ НА K1

ES = S*E0/ S+ (K2+K-1/K1) ПОДСТАВЛЯЕМ В ФОРМУЛУ СКОРОСТИ РЕАКЦИИ

V = K2ES

V = K2SE0/S + (K2+K-1/K1)

ПУСТЬ Vm=K2E0, Km= K2+K-1/K1

V= SVm/S+Km ДОМНОЖАЕМ НА S

V=Vm/ 1+(Km/S)

Далее чертим всем известную кривую с осями скорость-концентрация субстрата, отмечаем Vm и Km. Говорим, что К2 – мера каталитической активности фермента, или число оборотов фермента. К-1/к1 это Кs – субстратная константа.

Условия применимости:

• реакция односубстратная

• необратима

• быстрое наступление равновесия на стадии образования ФС комплекса

• эффектами продукта можно пренебречь

• концентр субстрата много больше конц фермента

• если к-1 много больше к2, то км примерно равно кs (чем меньше км, тем выше сродство фермента к субстрату)

3. Классификация оксидоредуктаз.

Систематические названия ферментов класса образуются по схеме «донор:акцептор + оксидоредуктаза». Когда возможно, ферменты называют в виде «донор + дегидрогеназа». В частном случае, когда окислителем является кислород, название может быть в виде «донор + оксидаза». Иногда название записывается как «акцептор + редуктаза», например НАД+-редуктаза.

Оксидоредуктазы осуществляют окисл-восстан реакции между донором и акцептором электронов, часто переносят е через кофактор или простетическую группу и может происходить в виде гидрид иона (никотинамидные коферменты), атомов водорода (флавиновые коферменты и простетические группы) или электронов (геминовые группы цитохромов).

Выделено 22 подкласса оксидоредуктаз. Например, КФ 1.1 включает ферменты, взаимодействующие с CH—OH группой доноров; КФ1.6 включает ферменты, взаимодействующие с НАД · H или НАДФ · H. Внутри каждого подкласса происходит разделение на подподклассы: КФ 1.1.1 Акцептор NAD или NADP, КФ 1.1.2 Акцептор- цитохром, КФ 1.1.3 Акцептор- кислород. Последнее число- номер ферментов, различного происхождения, катализирующих конкретную реакцию: ЕС 1.1.1.1 alcohol dehydrogenase.

Один и тот же шифр (например ) относится к лактатдегидрогеназам различных организмов. Изоферментный спектр также не находит своего отражения в номенклатуре. Таким образом, видовое, тканевое и структурное разнообразие в этой системе классификации не отражены.

Билет 6.

1. Типы ингибирования ферментов. Практическое применение ингибиторов ферментов. Определение типа ингибирования.

Типы ингибирования:

• Конкурентное ингибирование:

• Классическая модель

• S и I взаимно исключаются

• из-за стерических препятствий

• Связывании S и I осуществляется общим участком

• Участки связывания S и I различные, но они перекрываются

• Связывание I вызывает конформационные изменения, которые искажают центр связывания субстрата

EI  I + E + S  ES  E + P

V0= VmS/αkm + S

α = 1+ I/KI И KI = E*I/EI

1/V0 = αkm/Vm * 1/S + 1/VM Эффект ингибирования проявляется в изменении константы сродства. Ингибитор влияет на угол, на к1 – константу связывания.

• Неконкурентное ингибирование. Ингибитор влияет только на максимальную скорость реакции. Это маленькая молекула (ион), т.к. она не мешает связыванию. Но чаще всего ингибирования бывают смешанными.

1/V0 = αkm/Vm * 1/S + α’ /VM

• Бесконкурентное ингибирование. Ингибитор может присоединяться только к комплексу фермент-субстрат. Конформационные изменения после связывания субстрата позволяют связаться ингибитору.

1/V0 = km/Vm * 1/S + α/VM

• Ингибирование субстратом. Субстрат конкурирует с сородичем за фермент.

2. Активность ферментов. Единицы измерения.

Определение ферментативной активности:

• оценивание количества активного фермента в образцах (например, в задачах по выделению и очистке ферментов)

• исследование влияний условий протекания процесса (рН, температура, наличие эффекторов …) на каталитическую способность

• сравнение родственных (или модифицированных) ферментов по каталитической способности

• предварительное исследование для уточнения условий работы фермента перед проведением уточняющих кинетических экспериментов

1 единица активности - это образование 1 мкмоль продукта за 1 мин при стандартных условиях.

1 катал = 1 М за секунду; 1 катал = 60 000 000 Е

Варианты методов определения активности:

• протеолитическая (по гидролизу белка и осаждению непрореагировавшего ТХУ, а затем определение D280 или окрашивание реагентами)

• молокоствораживающая – время образования сгустка

• целлюлолитическая – отщепление сахаров от целлюлозы

3 . Классификация изомераз. Примеры отдельных представителей.

Систематическое название их составляют с учетом типа реакции: «субстрат – цис-транс-изомераза». Так триозофосфатизомераза имеет систематическое название D-глицеральдегид-3-фосфат альдо-кето изомераза НФ 5.3.1.1. Этот фермент имеет полость внутри: бэтта складчатый слой фланкирован альфа спиралями (8 параллельных бэтта и 8 альфа). В отверстии лиз, глу, гис.

Механизм действия: обобщённое основание отщепляет протон от первого углеродного атома субстрата, образуется переходное состояние = планарный ен-диольный интермедиат. Гис и лиз облегчают состояние интермедиата, протонированная глу депротонируется (обобщённая кислота). Далее диссоциация продукта.

Билет 7.