Рекомбинация генов, кодирующих легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов

Участок ДНК в некоммитированной клетке, ответственный за синтез легкой цепи к-типа, включает три группы генов:

1) 250 VK-генов, каждый из которых кодирует 94—95 аминокислотных остатков Ус-домена;

2) 5 J-мини-генов (от англ. — joining), один из которых функционально не активен и называется в силу этого псевдогеном; каждый из работающих J-генов кодирует последовательность из 12 — 14 аминокислотных остатков и тем самым обеспечивает достройку V-гена до того количества нуклеотидных остатков, которое контролирует синтез полноценного Vк-домена;

3) Ск-ген кодирует константный регион легкой к-цепи.

Процесс рекомбинации начинается с объединения одного из Vк-генов с одним из J-мини-генов. Объединение этих сегментов ДНК происходит за счет делении (удаления) последовательности пар нуклеотидов, входящих в некодирующую (интронную) последовательность между V и J. Место рекомбинации V-J не является жестко фиксированным. В процессе рекомбинации объединение может происходить как между собственно основаниями V и J, так и между основаниями, соседствующими с этими сегментами. Подобные ошибки вносят дополнительную изменчивость в 3-й гипервариабельный участок V-домена.

В процессе рекомбинации принимают участие ферментные белки. Наиболее изученным из них являются RAG-1 и RAG-2, контролируемые соответствующими генами (англ. — recombination activating genes). С помощью этих белков осуществляется делеция некодируемых участков ДНК между V-J. Прошедшая первичная рекомбинация обеспечивает формирование к-локуса, который состоит из трех экзонов (кодирующих участков): L-сегмента, кодирующего лидерный пептид — участок незрелой к-цепи, который включает 20 — 25 аминокислотных остатков; рекомбинантного VJ-гена и С-гена константной области.

Подобная рекомбинантная ДНК в коммитированных клетках обеспечивает образование первичного транскрипта — пре-мРНК ядра. В результате процессинга (созревания пре-мРНК ядра) некодируемые участки между J и С, а также между L и V вырезаются. Таким образом, зрелая, связанная с полирибосомами РНК лишена некодирующих последовательностей. При этом все кодирующие последовательности оказываются слитыми в единый информационный участок. Зрелая мРНК транслирует полипептид с дополнительным лидерным участком (L) аминокислотных остатков. Предполагается, что лидерный участок, включающий в основном гидрофобные аминокислоты, способствует прохождению к-цепи через мембрану эндоплазматического ретикулума. После прохождения он отщепляется, и зрелая к-цепь приобретает, наконец, тот аминокислотный состав, который характерен для секретируемого иммуноглобулина.

Несколько иначе организованы гены для А-типа легких цепей (IgLJ. Собственно V^-гены на хромосоме образуют локальное семейство, а каждый J-сегмент объединен в пару с соответствующим С-геном (Jl-Cl, J2-C2, J3-C3 и т.д.). На сегодня известно семь таких J-C-локусов. Процесс же рекомбинации в своей основе не отличим от того, который описан для к-типа легких цепей. В отличие от генетического контроля V-доменов легких цепей V-домены тяжелых цепей кодируются тремя генными сегментами: V, D и J. Кроме того, в отличие от генов легких к-цепей, включающих только один С-ген константной области, у человека таких генов десять, у мышей восемь. Они ответственны за кодирование классов и подклассов иммуноглобулинов.

При образовании участка генома, кодирующего V-домен тяжелых цепей, происходит два рекомбинационных события. Первое — это объединение D- и J-сегментов (мини-генов) и второе — объединение DJ-участка с V-геном. На начальном этапе дифференцировки В-клеток происходит слияние VDJ-гена с геном, контролирующим константную область IgM (Сц). По мере функционального созревания В-клеток наблюдается переключение синтеза IgM на иммуноглобулины других классов и подклассов при сохранении исходной специфичности V-домена, т.е. происходит рекомбинация того же VDJ-гена с Сн-генами иных классов и подклассов. В целом в процессе развития отдельных В-клеточных клонов возможны две формы реорганизации генома: разные VDJ-гены объединяются с одним и тем же Сн-геном, что обепечивает формирование разных клонов (ранний этап развития В-клеток), и один и тот же VDJ-ген образует единый информационный участок с разными С-генами (внутриклеточное переключение синтеза с одного класса на другой). Случайная рекомбинация генных сегментов — основа вариабельности иммуноглобулинов.

14) B-лимфоциты: дифференцировка, роль стромы костного мозга

Стадии развития от стволовой кроветворной клетки до незрелого В-лимфоцита происходят на территории костного мозга под прямым воздействием стромального микроокружения. Простым доказательством подобного утверждения являются опыты in vitro. Удаление из клеточной культуры стромальных элементов прерывает формирование В-лимфоцитов из стволовых клеток костного мозга. Реконструкция культуры восстанавливает процесс накопления В-клеток.

Участие клеток стромы в дифференцировке В-лимфоцитов проявляется в двух формах. Ранние этапы развития В-лимфоцитов зависят от прямого контактного взаимодействия со стромальными элементами. На более поздних этапах В-лимфоциты испытывают воздействие гуморальных факторов.

Взаимодействие наиболее ранних предшественников В-клеток со стромальными клеточными элементами осуществляется с помощью поверхностных адгезивных молекул ( рис. 8.1 ).

Первые контактные отношения возникают на уровне стволовой кроветворной клетки и общего лимфоидного предшественника лимфоцитов через взаимодействие между гиалуроновой кислотой клеточной поверхности стромальных клеток и CD44 . Это типичный адгезивный белок с относительно небольшим мол. весом 80-95 кД, хорошо представленный на поверхности различных типов лейкоцитов и эритроцитов . Помимо участия в установлении физического контакта между клетками стромы и ранними предшественниками В-клеток, он принимает участие в других формах межклеточных взаимодействий, а также в процессах клеточной миграции и метастазирования . Вероятно, связывание CD44 с лигандом не несет какой- либо прямой сигнальной функции, но стимулирует взаимодействие рецептора c-kit ранних про-В-клеток с другим рецептором стромальных клеток - SCF (англ. stem-cell factor).

Молекула c-kit обладает свойствами тирозинкиназ . В результате связывания этих поверхностных молекул происходит активация c-kit, что влечет за собой усиление пролиферации и переход В-клеточных предшественников на более продвинутый уровень дифференцировки - стадию поздних про-В-клеток.

Этот этап дифференцировки характеризуется появлением на поверхности поздних про-В-клеток рецептора к интерлейкину-7 и включением в процесс этого цитокина , секретируемого стромальными клетками. Активность интерлейкина-7 в качестве ростового фактора вполне достаточна для поддержания пролиферации и выживания развивающихся клеток. В результате их зависимость от SCF снижается и на стадии пре-В-клеток полностью прекращается. Контакт пре-В-клеток со стромой осуществляют адгезины ICAM .

Процесс В-клеточного развития в костном мозге завершается формированием незрелой В-клетки , экспрессирующей поверхностный IgM и подготовленной к миграции на периферию.

Кроме отмеченных, имеется еще целый ряд рецепторов ( СD45R , СD19 , СD38 , CD40 , CD20 , CD21 ), позволяющих следить за развитием В-клеток ( табл. 8.1 ). Функция этих поверхностных структур не является прерогативой только развивающихся В-клеток. Они включены в процессы клеточного взаимодействия, представления антигена в иммуногенной форме и др.