1.2.3. Кількісне визначення рнк віл-1

Визначення рівня вірусного навантаження за кількістю РНК-копій ВІЛ-1 в 1 мл плазми крові проводили методом полімеразної ланцюгової реакції і зворотньої транскрипції (ЗТ-ПЛР) з використанням комерційних тест-систем «RealTime HIV-1» (Abbott).

Для ампліфікації РНК ВІЛ-1 з клінічних зразків використосується технологія зворотньої транскрипції. На початку процесу пробопідготовки до кожного зразка вноситься послідовність РНК, неспоріднена послідовності ВІЛ-1. Ця неспоріднена послідовність РНК ампліфікується разом з послідовністю ВІЛ-1 і виступає у якості внутрішнього контролю, за допомогою якого контролюється правильність проходження реакції у кожному зразку. Кількість РНК ВІЛ-1, що присутня в кожному циклі ампліфікації, вимірюється за допомогою флуоресцентно-мічених олігонуклеотидних проб на приладі. До того часу, поки проба певним чином не зв’яжеться з ампліфікованим продуктом, вона не генерує сигналу. Цикл ампліфікації, на якому флуорисцентний сигнал реєструється приладом, пропорційний логарифму концентрації РНК ВІЛ-1 в плазмі [9].

Проведення ЗТ-ПЛР здійснювали у 2 етапи. Під час першого проводили підготовку зразків, а на другому – власне ампліфікацію.

Підготовку зразків здійснювали у такій послідовності: спочатку розморожували контролі тест-системи, внутрішній контроль, калібратори (якщо є необхідність відкалібрувати прилад), реагенти для ампліфікації і переносили їх у зону приготування зразків. Потім перевіряли наявність кристалів у пробірках тест-системи. За наявності кристалів, їх залишали за кімнатної температури для повного розчинення. Кожен внутрішній контроль перемішували на вортексі протягом 2-3 секунд перед використанням. Використовуючи точно відкалібровані піпетки, до кожного флакона буферу для лізісу вносили по 500 мкл внутрішнього контролю. В якості внутрішнього контролю використовували негативну плазму людини, тобто таку, яка не містить інфекційної РНК ВІЛ-1 та РНК вірусу гепатиту С, а також поверхневого антигену вірусу гепатиту В людини. Лізуючий буфер – це 100 мМ розчин Tris, що містить тіоцинату гуанідину та детергент. Акуратно перевертаючи флакони, гомогенізували вміст.

Підготовку клінічного матеріалу здійснювали таким чином: спочатку центрифугували пробірки при 2 000 об./хв. протягом 5 хв. Ця процедура є необхідною для розділення плазми від формених елементів крові, а також дозволяє збільшити діапазон чутливості методу. Відбирали по 1 мл плазми у чисту пробірку. Перед завантаженням в апарат Abbott m2000 sp System кожен зразок тричі перемішували на вортексі протягом 2-3 секунд. Досліджувані зразки, калібратори і контролі поміщали у лунки відповідно до дослідницької схеми протоколу приладу. Крім внутрішнього використовували негативний, слабо позитивний і виражено позитивний контролі, що теж являли собою негативну плазму людини. У каретці підсистемі приладу розташовували реакційні пробірки. Наприкінці завантажували реагенти системи пробопідготовки і 1,5 мілілітрові пробірки для збору зразків в апарат. Набір реагентів представлений крім лізуючого буферу також промиваючим буфером 1 (50 мМ ацетатний буфер, що містить тіоцианат гуанідину і детергент, промиваючим буфером 2 (вода, вільна від нуклеаз), буфером для елюації (20 мМ розчин фосфатного буферу з консервантом) і мікрочастинками для сорбції нуклеїнової кислоти. Змішування реактивів для ампліфікації і елюація зразків здійснювалися автоматично після запуску дослідницького протоколу апарата.

Ампліфікацію зразків здійснювали на апараті Abbott m200rt. Спочатку готували суміш майстер-міксу: у пробірку із термостабільною ДНК-полімеразою rTth (зворотня транскриптаза) вносили 271 мкл активуючого реагенту (30 мМ розчин хлориду марганцю) і 949 мкл олігонуклеотидів (< 0,1% синтетичних олігонуклеотидів: 4 праймери, 2 проби і 1 олігонуклеотид-погашувач флуоресценції і < 0,3 % dNTPs в буферному розчині). Готову суміш майстер-мікс переносили у вільну від ДНКаз/РНКаз пробірку і перемішували на вортексі. Потім 96-лунковий планшет ставили у кулер і вносили по 50 мкл суміші майстер-міксу для ампліфікації у лунки і по 50 мкл елюату зразків, перемішуючи компоненти реакції 3-5 разовим піпетуванням. Далі планшет заклеювали і переносили у бризкопогашувач, встановлювали в прилад і запускали протокол виконання аналізу Abbott RealTime HIV-1.

Результати отримували в РНК-копіях в 1 мл плазми. За кількістю РНК-копій визначали ефективність АРТ. Діапазон чутливості приладу становив від 40 до 10 000 000 РНК-копій/мл.

Як альтернативу даному методу можна застосовувати тест-системи, які базуються на технології так званої «branched DNA» і також дозволяють визначати кількість вірусних частинок [9].

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Антиретровірусна терапія в Україні та її вплив на формування резистентності ВІЛ до лікарських препаратів - Матеріали науково-практичної конференції та пленуму Асоціації інфекціоністів України «Інфекційні хвороби у клінічній та епідеміологічній практиці», 21-22 травня 2009 р., м. Львів, с. 74-76. - Люльчук М.Г., Бабій Н.О., Щербінська А.М., Антоненко С.В., Доан С.І.

2. Бабій Н.О. Вплив збудників захворювань вірусної етіології на реплікативну активність ВІЛ у хворих на ВІЛ-інфекцію: Автореф. дис… канд. біол. н.: 03.00.06 / Київський національний університет імені Тараса Шевченка. – К., 2008. – 34 с.

3. Клінічний протокол антиретровірусної терапії ВІЛ-інфекції у дорослих та підлітків.– К.: М-во охорони здоров’я України, 2004.– С. 12.

4. Люльчук М. Г. Характеристика епідемічного процесу ВІЛ-інфекції в Україні в залежності від шляху інфікування: Автореф. дис… канд. мед. н.: 14.02.02 / Iн-т епідеміол. та інф. хвороб. – К., 2005. – 24 с.

5. Малдарелли Ф. Резистентность ВИЧ к лекарственным препаратам. - http://www.eurasiahealth.org.

6. Поліщук В.П., Молчанець О.В. ВІЛ/СНІД та формування здорового способу життя. – К. – 2008. – 175 с.

7. Ребриков Д.В. ПЦР в реальном времени. – М. – 2009. – 223.

8. Хайдуков С.В. Основные принципы и технологии проточной цитометрии. – М. – 2008.

9. Clementi M., Menzo S., Bagnarelli P., Aldo Manzin Quantitative PCR and RT-PCR in virology // - Genome Research. – 1993. - № 2. - PP 191-196.

10. Clercq E. The design of drugs for HIV and HCV // Nature Reviews. Drug discovery. Vol. 6. – 2007. – P. 1001 – 1018.

11. McCutchan FE. Understanding the genetic diversity of HIV-1 // AIDS. – 2000. – Vol. 14. – P. 31 – 44.

12. Pomerantz R., Horn D. Twenty years of therapy for HIV-1 infection // Nature Medicine. – 2003. – Vol. 9, № 7. – P. 867 – 873.

13. Wilkin T., Shalev N., Hammer S. Advances in antiretroviral therapy // Topics in HIV medicine. – 2010. – Vol. 18, № 2. – P. 66 – 92.