Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
МОЯ ПРАКТИКА.docx
Скачиваний:
0
Добавлен:
20.09.2019
Размер:
49.51 Кб
Скачать

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

«КИЄВО-МОГИЛЯНСЬКА АКАДЕМІЯ»

Факультет природничих наук

Кафедра біології

ЗВІТ

з проходження дослідницької практики

студентки 3 р.н.

Лотоцької Людмили Віталіївни

КИЇВ - 2010

ЗМІСТ

ВСТУП ...........................................................................................................3

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА .........................................................7

    1. Об’єкт досліджень ..............................................................................7

    2. Методи досліджень ............................................................................7

      1. Визначення субпопуляцій лімфоцитів (СD3, CD4, CD8) з використанням моноклональних антитіл методом проточної цитофлюориметрії………………………………..7

      2. Виявлення провірусної ДНК ВІЛ-1 в клінічному матеріалі…………………………………................................9

      3. Кількісне визначення РНК ВІЛ-1 .........................................13

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ ............................................16

ВСТУП

Дослідницька практика проходила у відділі ВІЛ та ВІЛ-асоційованих інфекцій Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України.

Мета практики полягала в опануванні імунологічних та молекулярно-генетичних методів, які застосовуються для вивчення патогенетичних аспектів ВІЛ-інфекції. Отримано навики роботи з проточним цитофлюориметром, гематологічним аналізатором, опановано методики проведення полімеразної ланцюгової реакції.

Одним із основних напрямків діяльності відділу ВІЛ та ВІЛ-асоційованих інфекцій є вивчення молекулярно-біологічних властивостей популяції ВІЛ, що циркулює в Україні, і патогенетичних механізмів розвитку ВІЛ-інфекції в умовах застосування широкомасштабної антиретровірусної терапії ВІЛ-інфікованих та хворих на СНІД. Так, співробітниками відділу вперше в Україні було розпочато вивчення молекулярно-біологічних властивостей популяції ВІЛ-1, що циркулює в окремих областях, визначення факторів, які впливають на систему захисту клітин-мішеней на різних стадіях ВІЛ-інфекції та обумовлюють особливості перебігу ВІЛ-інфекції/СНІДу. Здійснено моніторинг циркулюючих субтипів ВІЛ-1, що є невід'ємною складовою характеристики епідемії ВІЛ-інфекції. Встановлено домінування субтипів А і В ВІЛ-1 та шляхи їх поширення регіонами України, визначено рівень циркуляції рекомбінантних (А/B, A/E) та мультиваріантних штамів вірусу [4].

Нині значна увага дослідників всього світу зосереджена також на аналізі вірусологічної ефективності антиретровірусної терапії ВІЛ-інфікованих пацієнтів. Метою АРТ є максимальне пригнічення реплікації ВІЛ, відновлення функцій імунної системи, продовження та підвищення якості життя ВІЛ-інфікованих. Тому працюючи над створенням нових препаратів, вчені розглядають АРВ терапію (АРВТ) як один із найдієвіших способів попередження та лікування ВІЛ-інфекції. З епідеміологічної точки зору, ефективна АРВТ, пригнічуючи реплікацію ВІЛ в організмі хворої людини, зменшує ризик передачі ВІЛ. Тож забезпечення доступу до АРВТ всіх ВІЛ-інфікованих, хто її потребує, є важливим заходом щодо зменшення поширеності ВІЛ-інфекції [3].

Всього для лікування використовується 152 комбінації антиретровірусних (АРВ) препаратів , які в свою чергу поділяються на окремі класи [10, 12]:

  1. нуклеозидні інгібітори зворотньої транскриптази, механізм дії яких полягає у здатності переривати будування ланцюга провірусної ДНК ВІЛ у процесі зворотньої транскрипції на ранніх етапах життєвого циклу вірусу;

  2. ненуклеозидні інгібітори зворотньої транскриптази, які мають здатність інактивувати вказаний фермент вірусу за рахунок зв’язування з його активним центром;

  3. інгібітори протеази ВІЛ, котрі блокують фермент, запобігаючи дозріванню вірусного білка-попередника;

  4. інгібітори фузії та CCR5-інгібітори, які перешкоджають проникненню вірусних часток у клітини-мішені;

  5. інгібітори інтегрази ВІЛ, механізм дії яких полягає в пригніченні процесу інтеграції вірусного геному.

Головним показником ефективності АРВ-терапії є рівень вірусного навантаження ВІЛ. Так, при дослідженні нуклеотидних послідовностей штамів ВІЛ-1 було встановлено, що при рівні вірусного навантаження менше 50 РНК-копій/мл не відбувається формування резистентних штамів вірусу – це найбільш вагомий аргумент на користь підтримки вірусного навантаження на низькому рівні впродовж тривалого часу. І навпаки, рівень вірусного навантаження більш як 50 РНК-копій/мл свідчить про неефективність АРВ-терапії і можливість виникнення резистентних штамів [11].

На базі відділу проводяться дослідження з контролю ефективності антиретровірусного лікування ВІЛ-інфікованих та хворих на СНІД осіб шляхом визначення рівня вірусного навантаження ВІЛ-1 у зразках крові ВІЛ-інфікованих пацієнтів та визначення наявності провірусної ДНК ВІЛ-1 у дітей, народжених ВІЛ-інфікованими матерями [1]. Основний метод, який застосовується у даних дослідженнях – метод полімеразної ланцюгової реакції в режимі «реального часу» (із зворотньою транскрипцією та без неї). Крім молекулярно-генетичних вагому роль відіграють й імунологічні та гематологічні методи дослідження клінічного матеріалу ВІЛ-інфікованих. Так, методом проточної цитофлюориметрії здійснюється контроль за необхідністю АРВ-терапії, який полягає у тому, що за співвідношенням CD4/СD8 (поверхневих маркерів Т-хелперів та цитотоксичних Т-лімфоцитів) визначається індекс імунореактивності пацієнта, за яким можна передбачити стан імунної системи хворого і відповідно, критерії тяжкості перебігу ВІЛ-інфекції.

Варто зазначити, що хоч на АРВ-терапію і покладаються великі надії щодо профілактики і лікування ВІЛ-інфекції та СНІДу, проте залишається чимало ще невирішених та дискусійних питань. Так, однією із найбільш резонансних проблем сучасної науки є поява мутацій резистентності ВІЛ, спричинених широким використанням в клінічній практиці антриретровірусних препаратів. Вважається, що наразі не створено жодного антиретровірусного препарату, до якого ВІЛ не зміг би стати резистентним [10]. До того ж, мутації резистентності можуть виникати швидко і безперешкодно: іноді для розвитку резистентності високого рівня достатньо точкової мутації в одному кодоні, в інших випадках рівень резистентності зростає поступово, в міру накопичення мутацій в різних кодонах, кожна з яких підвищує стійкість ВІЛ до терапії в невеликій мірі [5].

На сьогоднішній день дослідниками встановлено і вивчено ряд мутацій, проте досі не існує єдиної системи їх класифікації. Серед кожної із груп АРВ-препаратів найбільш поширеними є мутації заміни, а також інсерції та делеції [5, 13].

Вивчення механізмів формування мутацій резистентності ВІЛ до АРВ препаратів має велику практичну цінність. Нині тести на резистентність стають невід’ємною частиною АРВ терапії ВІЛ-інфікованих та хворих на СНІД. Адже за допомогою гено- і фенотипування ВІЛ встановлюються причини неефективності АРВ терапії, отримані дані інтерпретуються таким чином, що це дозволяє підбирати схеми лікування практично індивідуально.

Враховуючи актуальність даної проблеми, у відділі ВІЛ та ВІЛ-асоційованих інфекцій впроваджуються дослідження механізмів формування та розповсюдження мутацій, асоційованих з резистентністю ВІЛ до певних антиретровірусних препаратів. Так, завдяки аналізу геному ВІЛ-1 співробітниками відділу здійснено оцінку рівня первинної резистентності у «наївних» пацієнтів (нещодавно інфіковані і не отримують АРВ терапію) та охарактеризовано особливості накопичення мутацій резистентності і поліморфічних замін нуклеотидів [1].

Варто також зазначити, що окремим напрямом діяльності співробітників відділу є вивчення молекулярно-генетичних та серологічних маркерів вірусних інфекційних захворювань, які передаються перентеральним, статевим або повітряно-крапельним шляхом і є асоційовані з ВІЛ-інфекцією. Так, вперше в Україні вивчено частоту активації збудників таких коінфекцій, як герпесвіруси, віруси гепатиту В і С у хворих на ВІЛ-інфекцію/СНІД в залежності від стадії ВІЛ-інфекції, шляху інфікування ВІЛ та прийому АРВ-препаратів. Дано теоретичне узагальнення та вирішення актуальної задачі вірусології щодо встановлення зв'язку між активністю збудників захворювань вірусної етіології (герпесвірусних інфекцій, гепатитів В і С) та рівнем реплікативної активності ВІЛ у хворих на ВІЛ-інфекцію/СНІД [2].

Експериментальна частина

1.1 Об’єкт досліджень

Оскільки дослідження, які проводяться у відділі, мають на меті охопити різнобічні аспекти ВІЛ-інфекції, то використовуються різні об’єкти вивчення. Так для імунологічних досліджень об’єктом дослідження є різні субпопуляції лімфоцитів периферичної крові.

Що стосується молекулярно-генетичних досліджень, які базуються на методі полімеразної ланцюгової рекції, то об’єктом дослідження є клінічний матеріал (периферична кров з антикоагулянтом або плазма) на предмет наявності і кількосного вмісту генетичного матеріалу ВІЛ-1 (РНК-копій/мл).

1.2. Методи досліджень

1.2.1. Визначення субпопуляцій лімфоцитів (сd3, cd4, cd8) з використанням моноклональних антитіл методом проточної цитофлюориметрії.

Визначення субпопуляцій лімфоцитів є важливою процедурою для встановлення необхідності АРВ терапії.

Послідовність дій при постановці дослідження наступна:

  1. Кожну пробірку промаркувати і внести по 100 мкл крові пацієнта добре перемішаної з антикоагулянтом. Антикоагулянт, який застосовувався в дослідженні – К3ЕДТА. Він є необхідним для того, щоб кров не згорталася, адже згустки є непридатними у дослідженні.

  2. У кожну пробірку вносимо по 10 мкл моноклональних антитіл з відповідними барвниками. Використовували комерційний набір, куди входили такі барвники: CD8 – FITC (ізотіоціанат флуоресцину), CD4 – PE (фікоеритрин) та CD3 – PC5 (тандемний барвник).

  3. Ретельно перемішати зразок крові з антитілами за допомогою вортексу (уникати розбризкування крові по стінках пробірки) для рівномірного зафарбовування клітин крові.

  4. Провести інкубацію при кімнатній температурі у темному місці протягом 15 хвилин. Протягом цього часу відбувається зв’язування антитіл з антигенами клітинної стінки.

  5. Увімкнути станцію пробопідготовки.

  6. Провести лізування зразка у станції пробопідготовки. Лізування здійснюється для того, щоб зруйнувати еритроцити і відповідно зменшити похибку результату.

  7. Для визначення абсолютної кількості клітин до лізованого зразка додати 100 мкл ретельно перемішаних калібрувальних частинок FLOW-COUNT, відносно яких і здійснюється перерахунок клітин.

  8. Провести процедуру визначення вмісту лімфоцитів і відповідних субпопуляцій на проточному цитометрі.

Визначення вмісту відповідних субпопуляцій лімфоцитів проводили на цитометрі Cytomics FC 500. Даний прилад дозволяє аналізувати як розмір, так і структуру клітин завдяки тому, що у його структурі є такі системи як проточна лунка, лазер, оптично-аналізуюча система. Підготовлений зразок подається в проточну лунку, де є стискаюча рідина. Під дією цієї рідини утворюється ламінарний потік клітин таким чином, що в лунці вони рухаються по одній. Це дозволяє фіксувати за допомогою лазеру клітини і просторово їх розділяти. Аналіз розмірів та структури здійснює оптично-аналізуюча система, яка представлена детектором бокового освітлення (світлорозсіяння здійснюється під кутом <10°) і прямого освітлення (світлорозсіяння під кутом 90°). Для реєстрації флуоресценції є 5 каналів, кожен з яким реєструє флуоресценцію відповідного барвника. Результати отримували у вигляді графіків, на яких спостерігали криві з відповідними піками флуоресценції того чи іншого барвника. За допомогою калібрувальних частинок здійснювався перерахунок клітин, таким чином отримували абсолютне і відносне число СD3, CD4, CD8 Т-лімфоцитів [8] .

Як альтернативу даному методу для визначення кількості Т-лімфоцитів можна використовувати метод імунофлуоресценції або ж лімфоцитотоксичний тест.