1.2.2. Виявлення провірусної днк віл-1 в клінічному матеріалі

Виявлення провірусної ДНК ВІЛ-1 є одним із методів, що використовуються для діагностування ВІЛ-інфекції на ранніх стадіях.

У даному дослідженні використовували метод полімеразної ланцюгової реакції в «реальному часі».

Схема експерименту наступна:

Етап 1. Виділення ДНК з клінічного матеріалу:

А. Лізис клінічного матеріалу.

1. Пробірки об’ємом на 1,5 мл промаркувати, окремо зазначивши контролі.

2. У пробірки для клінічних проб внести окремими наконечниками по 1 мл гемолітика (для того, щоб зрйнувати еритроцити) і по 0,25 мл дослідної крові. Закрити пробірки і перемішати їх вміст на вортексі.

3. Залишити пробірки при кімнатній температурі на 3 хв., а потім ще раз акуратно перемішати їх вміст на вортексі. Знову залишити на 3 хв.

4. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 8 тис. об/хв. протягом 2 хв. Відібрати надосадову рідину за допомогою вакуумного відсмоктувача.

5. До осаду додати 0,5 мл гемолітика, перемішати на вортексі і залишити на 3 хв.

6. Центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 8 тис. об/хв. протягом 2 хв. Відібрати надосадову рідину за допомогою вакуумного відсмоктувача.

7. Повторити відмивку лейкоцитів гемолітиком. Після останньої відмивки осад повинен бути білим, допускається невеликий наліт рожевого кольору над осадом (це, власне, є залишки зруйнованих еритроцитів).

8. Для подальшого лізування (тобто руйнування лейкоцитів) лізуючий розчин і розчин для відмивки 1 прогріти за температури 65°С до повного розчинення кристалів (оскільки дані реагенти зберігаються при температурі від 2 до 8 °С).

9. У кожну пробірку до осаду лейкоцитів додати по 300 мкл лізуючого розчину, перемішати на вортексі до повного суспендування клітин.

10. За допомогою вортексу ретельно ресуспендувати сорбент універсальний і додати у кожну пробірку з розрахунку по 25 мкл у кожну, після чого перемішати на вортексі, поставити в штатив на 10 хв., перемішуючи осад кожні 2-3 хв. (час, з яким здійснюється перемішування, залежить від кількості пробірок: чим більше пробірок, тим більший проміжок часу, але максимально допустимий проміжок між перемішуваннями – 3 хв.).

11. Осадити сорбент універсальний в пробірках центрифугуванням при 5 тис. об./хв. протягом 1 хв. Видалити супернатант, використовуюючи вакуумний відсмоктувач і окремий наконечник для кожної проби.

12. Додати у проби по 300 мкл розчину для відмивки 1, перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. Потім осадити сорбент центрифугуванням при 5 тис. об./хв. протягом 1 хв. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний відсмоктувач і окремі наконечники для проб.

13. Додати в проби по 500 мкл розчину для відмивки 2, перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту, знову процентрифугувати 1 хв. при 10 тис. об./хв., видалити супернатант. Процедуру здійснити ще раз.

14. Помістити пробірки в термостат при температурі 65°С на 10 хв. Це необхідно для того, щоб сорбент підсох, тому пробірки не закриваємо.

15. Додати у кожну пробірку по 50 мкл ТЕ-буферу для елюції ДНК. Перемішати на вортексі і помістити в термостат (65°С на 5 хв.).

16. Процентрифугувати пробірки при 14 тис. об./хв. протягом 1 хв.

Отриманий супернатант містить очищену ДНК, а тому проби можна використовувати для постановки полімеразної ланцюгової реакції.

Особливістю виділення провірусної ДНК є те, що спочатку здійснюється процес руйнування клітин крові. Якщо еритроцити можна легко зруйнувати гемолітичним розчином, то для руйнування лейкоцитів використовують сильні хаотропні агенти, наприклад, гуанідину тіоцианат. ДНК, яка вивільняється при цьому з ядра, сорбується на специфічних твердих носіях, що містять оксид кремнію. Після промивки сорбенту, на ньому залишається очищена ДНК, елюцію якої здійснюють розчинами з малою йонною силою (наприклад, ТЕ-буфер) [7].

Альтернативні методики виділення нуклеїнової кислоти полягають у тому, що замість сорбції ДНК на твердій фазі використовують поетапне видалення домішків з водного розчину, в якому знаходиться нуклеїнова кислота. Найбільш поширеною методикою є фенол-хлороформна екстракція. Крім того, можна застосовувати ферментативний протеоліз з подальшою депротеїнізацію і осадженням ДНК спиртом [7].

Етап 2. Проведення полімеразної ланцюгової реакції:

А. Підготовка реактивів для проведення ПЛР:

1. Відібрати необхідну кількість мікропробірок на 0,2 мл.

2. Приготувати реакційну суміш наступним чином:

- на одне дослідження:

а) ПЛР-суміш-1 – 15 мкл;

б) ПЛР-суміш-2 – 10 мкл;

в) Таq-полімераза – 1 мкл.

- на n-кількість досліджень:

а) ПЛР-суміш-1 – (n + 2 контролі + 1) х 15;

б) ПЛР-суміш-2 – (n + 2 контролі + 1) х 10;

в) Таq-полімераза – (n + 2 контролі + 1).

3. Перемішати реакційну суміш на вортексі.

4. Внести в мікропробірки по 25 мкл готової реакційної суміші.

Б. Проведення ампліфікації.

1. У пробірки з реакційною сумішшю внести по 23 мкл виділеної ДНК, перемішати піпетуванням 3 – 4 рази.

2. Приготувати 3 контролі:

а) К^- - замість ДНК внести 25 мкл ТЕ-буфера;

б) К⁺ - 25 мкл ПКО ДНК ВІЛ-1;

в) ВКО 25 мкл ПКО клітинної ДНК.

3. Поставити пробірки в реакційний модуль.

4. Запрограмувати прилад для виконання ампліфікації і детекції флуоресцентного сигналу згідно з інструкцією по експлуатації приладу.

Етап 3. Аналіз результатів. Отримані дані мають вигляд кривих , які накопичують флуоресцентний сигнал у двох каналах. Ці криві аналізуються за допомогою програмного забезпечення пристрою, що здійснює ПЛР в режимі «реального часу». Відповідно, в одному з каналів (JOE) реєструється накопичення продукту ампліфікації ДНК ВІЛ (ПКО) , а в іншому (FAM) – ВКО. Інтерпретація результатів здійснюється на основі наявності чи відсутності значення порогового циклу «C_t» у відповідній графі таблиці результатів, що має такий вигляд:

Контроль	Етап, який контролюється	Результат по значенню Ct
		Канал «JOE/Yellow»	Канал «FAM/Green»
ОК	виділення ДНК	Відсутній	відсутній
ПК	виділення ДНК	< 40 (позитивний)	відсутній
К-	ПЛР	Відсутній	відсутній
К+	ПЛР	< 40 (позитивний)	не оцінюють
В+	ПЛР	не оцінюють	< 20 (негативний)

Зразок вважається позитивним, якщо на каналі JOE/Yellow отримано значення C_t менше 40. Зразок є негативним, тобто таким, що не містить провірусну ДНК, у тому випадку, коли на каналі JOE/Yellow відсутнє значення С_t, при цьому значення на каналі FAM/Green є меншим, ніж 20 [7].

Як альтернативу даному методу для діагностики вірусоносійства на практиці застосовують метод імуноферментного аналізу і вестерн-блоттінг. Цей метод дозволяє виявляти антитіла до ВІЛ, що в свою чергу порівняно з полімеразною ланцюговою реакцією збільшує похибку, адже антитіла до ВІЛ з'являються лише через 1-3 місяці після інфікування, що унеможливлює діагностувати інфекцію на ранніх етапах [6].