12.Методы получения фаголизатов

Фаголизат - суспензия бактериофага, полученная после лизиса зараженных фагом клеток бактерий. Для получения фаголизатов можно использовать как жидкие, так и агаризованные питательные среды. Фаголизат получают путем размножения фага на клетках чувствительной культуры. В бульонную культуру бактерий E.coli B вносят 1-2 мл фаговой суспензии, либо касаются бактериальной петлей изолированной негативной колонии и эмульгируют ее в питательном бульоне. После соответствующего периода инкубирования и просветления сус-

пензии фаголизат освобождают от бактериальных клеток одним их следующих способов:

1) фильтрованием через мембранный фильтр;

2) центрифугированием для осаждения клеток (6000 об/ми, 10мин);

3) обработкой фаголизата хлороформом в соотношении 10:1 с последующим энергичным встряхиванием в течение минуты, инкубированием в течение часа при комнатной температуре и центрифугированием.

Техника получения фаголизатов бактериофагов Т-группы в жидкой питательной среде

18-24 часовую культуру чувствительных к фагу бактерий (E. coli B) засевают в жидкую питательную среду в соотношении 1:10 и культивируют с аэрированием при оптимальных условиях (37о С) до логарифмической фазы роста в течение 2,5 - 3 ч (до плотности 2х108 кл/мл). После этого в бактериальную культуру добавляют суспензию фага с таким расчетом, чтобы множественность инфекции составляла 1, и продолжают инкубирование в течение 6 - 8 часов с аэрацией до просветления бактериальной культуры. Фаголизат освобождают от бактерий низкоскоростным центрифугированием (6000 об/мин, 10 мин) или фильтрованием через бактериальные фильтры и определяют титр полученного фага. В жидкой среде можно получать большие объемы фаголизатов с содержанием фаговых частиц около 5 х 109 частиц/мл.

Техника получения фаголизата бактериофагов Т-группы на агаризованной питательной среде

Этот метод, предложенный М. Свансторомом (M. Swanstrom) и М. Адамсом (M. Adams) в 1951г., заключается в лизисе фагом густой суспензии чувствительных бактерий в слое полужидкого агара. В 3 мл 0,7% агаризованной питательной среды вносят 0,1 мл культуры чувствительных бактерий E. coli B в логарифмической фазе роста и 1 мл суспензии одного из фагов Т-группы (конечная концентрация 104 - 105 частиц/ мл), перемешивают и выливают на поверхность 1,5 % агаризованной питательной среды в чашках Петри. Таким образом проводят засев нескольких чашек. Чашки инкубируют в течение 18 - 20 часов, а затем в каждую из них вносят 5 мл физиологического раствора или жидкой питательной среды и шпателем осторожно снимают верхний (0,7%) слой агара. Для удаления бактерий и остатков агара полученную массу центрифугируют (6000 об/мин, 10 мин). После серии разведений полученного фаголизата определяют титр фага. Экспериментально выявлено, что на плотной питательной среде количество полученного фаголизата оказывается меньше, чем в случае приготовления его в жидкой питательной среде, но титр бактериофага в этом случае несколько выше – 109 – 1011 частиц/мл.