Шляхи асиміляції аміаку в рослині

Важливим джерелом азотного живлення є амонійний азот (NН₄). В рослину він надходить навіть швидше, ніж нітрати, адже для його використання у синтезі органічних сполук виклю­чається процес відновлення, що характерне для нітратів. Це основна і, ймовірно, єдина сполу­ка, що включається в процеси азотного обміну. Амонійний азот може бути різного походження: безпосередньо надходити з грунту, утворюватися внаслідок відновлення нітратів або в резуль­таті вторинного розпаду білку в старіючих органах і клітинах.

Аміак (амоній) включається в метаболізм через синтез різних амінокислот та амідів. Для асиміляції амонію суттєве значення має діяльність трьох таких ферментів: глутаматдегідрогеназа, глутамінсинтетаза та глутаматсинтетаза.

Аміак може включатися в обмін речовин шляхом амінування багатьох сполук, однак провідна роль первинного зв'язування аміаку належить реакціям біосинтезу глутамінової кислоти та її аміду — глутаміну. Можливий шлях — відновлювальне амінування а-кетоглутарової кислоти, що каталізується глутаматдегідрогеназою. Глутаматдегідрогеназа виявлена практично у всіх вищих рослин. В коренях і листках вона локалізована переважно в мітохондріях, хоч невелика кількість її виявлена і в хлоропластах.

Глутамінсинтетаза каталізує реакцію, в якій глутамат функціонує як акцептор аміаку для утворення глутаміну. Глутамінсинтетаза локалізована в хлоропластах та цитоплазмі і каталізує утворення глутаміну з глутамату з одночасним розщепленням АТФ до АДФ.

Глутаматсинтетаза каталізує відновлювальне перенесення амідо-амінної групи з глутамату на 2-оксиглутарат, в результаті чого утворюється дві молекули глутамату.

Сучасні уявлення про механізм відновлення молекулярного азоту організми, які здійснюють азотфіксацію

Молекулярний азот атмосфери засвоюється лише мікроорганізмами. Відомо два роди архебактерій, 38 родів бактерій та 20 родів ціанобактерій, які здійснюють азотфіксацію. Всі вони одержали назву діазотрофи. Найважливіші з них бактерії родів (Азотобактер, Клострідіум), деякі актиноміцети (Франкія), ціанобактерії (Анабена, Носток) та симбіотичні бактерії роду Різобіум. Недавно виявлено, що до азотфіксації здатні бактерії — метаногени (Метанобактеріум), які обумовлюють утворення метану. Необхідно відмітити, що перевірка методом радіоактивних ізо­топів не підтвердила здатності до азотфіксації, виділених із грунту видів дріжджів та плісневих грибів, як це вважалося раніше. Серед азотфіксаторів розрізняють:

• вільноживучі організми (Азотобактер, Клострідіум);

• симбіотичні асоціації їх з вищими рослинами.

В грунті серед вільноживучих організмів переважають бактерії, а в водному середовищі роль азотфіксаторів належить ціанобактеріям. Як приклад симбіотичних систем можна привес­ти бактерії роду Різобіум та бобових рослин, асоціативні симбіози між бактеріями та вищи­ми рослинами.

Несимбіотичні бактерії здатні додавати близько 7 кг азоту на гектар ріллі на рік.

Процес засвоєння молекулярного азоту повітря мікроорганізмами називають біологічною азотфіксацією, а відповідні мікроорганізми — азотфіксаторами. З вільноживучих азотфіксаторів досить відомі аеробний Азотобактер та анаеробний Клострідіум. Серед симбіотичних — бульбоч­кові бактерії, особливо роду Різобіум, які утворюють особливі вирости на коренях бобових рослин. Крім бобових цією здатністю володіють також лишайники, мохи, вільха, обліпиха, де­які папороті, розоцвіті, злаки та осокові.

Здатністю до азотфіксації володіє не сама рослина, а мікроорганізми, що знаходяться з нею в симбіозі (бактерії, актиноміцети, ціанели).

Симбіотичні системи. З сільськогосподарської точки зору ці системи відіграють важливу роль, тому що:

• азот фіксується безпосередньо поблизу до кореневих систем, які так його потребують;

• хоча частина амонію, утвореного в результаті фіксації, і використовується мікросимбіонтом для власного росту і розвитку, все ж більша частина його експортується в клітини господаря.

Розглянемо симбіоз бобових, у яких існує специфічність по відношенню до колонізуючих їх бактерій (роду Різобіум). Цей вид бактерій існує в усіх грунтах, але у вільному стані вони не здатні до азотфіксації. Бактерії колонізують корені рослин в період появи перших листків. Пер­шим до колонізації кроком є розпізнавання різними видами роду Різобіум рослини-хазяїна. В цьому процесі важлива роль належить лектинам, специфічним рослинним білкам, які можуть, зв'язуватись із залишками цукрів (вуглеводів), склеюючи поверхні суміжних клітин шляхом спо­лучення їхніх полісахаридиих груп. Ці лектини можуть взаємодіяти із специфічними бактеріями даного роду, що забезпечує рослині пізнавання та контакт з потрібним видом.

Бактерії потрапляють в рослину крізь кореневі волоски, що деформуються під впливом якоїсь гормоноподібної речовини, яка виділяється бактерією. Від місця проникнення бактерій в кореневий волосок розвивається тяж, по якому бактерії рухаються в тканину кореня, розмно­жуючись при цьому. Після заселення рослини одним штамом інші уже в нього не проникають (звідси, з практичної точки зору, виникає потреба мати найефективніші азотфіксуючі штами).

Заселення клітин кореня рослини-хазяїна розпочинається після звільнення бактерій із тя­жа і пов'язане з діяльністю двох ферментів, які гідролізують клітинну стінку. Це пектиназа з клітин бактерій та целюлаза з клітин рослин. Вони сприяють проникненню бактерій в клітини рослин, де продовжують ділитися. Рослинна клітина збільшується в розмірах, переповнюється бактеріями, змінює свою будову та функцію, перетворюючись на бактероїд, що і відповідає за азотфіксацію.

Одночасно з проникненням бактерій в клітину рослини-хазяїна розпочинається активне ділення інфікованих клітин та сусідніх неінфікованих, що сприяє поширенню бактерій і зумов­лює формування кореневих бульбочок, характерних для симбіотичних асоціацій.

Причому внутрішня частина інфікованих та неінфікованих клітин завжди оточена кортикаль­ним шаром незаражених клітин хазяїна.

Інфіковані частини внутрішньої зони зрілої кореневої бульбочки можуть містити один або кілька бактероїдів. Вони оточені мембранною оболочкою, в якій, можливо, локалізований червоний пігментний білок — фітоглобін (по типу гемопротеїду крові — гемоглобін, м'язів — міоглобін, в рослин — фітоглобін). Він утворюється лише в фіксуючих азот бульбочках і знаходиться в інфікованих клітинах, становлячи до 30-40% всього розчинного білка клітини. Його синтез кодується ДНК геному клітини хазяїна, а не ДНК бактерій.

Допускають, що в бактероїдах функціонує, ймовірно, вмонтований у мембрану дихальний ланцюг, близький за будовою до класичного ланцюга перенесення електронів мітохондрій та спряжене з ним фосфорилування. Цей ланцюг бере участь в синтезі АТФ, яка так необхідна при азотфіксації.

Отже, щоб симбіотична система могла фіксувати азот, необхідно: утворення кореневих бульбочок, диференціація бактерій в бактероїди та утворення фітоглобіну. Фіксація продовжується до старіння бульбочок, а деякі з них живуть до початку нового вегетаційного періоду.

Симбіози водоростей виникають при асоціації синьозелених з вищими рослинами. Однак, на відміну від Різобіум та актиноміцетів, які вступають в симбіоз з квітковими рослинами, ціанобактерії вступають в симбіоз з нижчими формами (лишайниками, печіночниками та ін.).

Сучасні уявлення про відновлення молекулярного азоту. Хоч нас оточує океан молекулярного азоту, молекула азоту настільки міцно зв'язана, що для розриву трьох ковалентних зв'язків потрібно 940 кДж/моль. Тому технічний синтез аміаку потребує температуру порядку 500 °С та тиск 300-350 атм., тоді як мікроорганізми-азотфіксатори функціонують у звичайних умовах. Це пояснюється тим, що вони мають специфічні ефективні ферментні системи, що каталізують окремі процеси азотфіксації.

Саме тому проблема біологічної фіксації азоту займає значне місце в наукових лабораторіях світу. Слід підкреслити, що в усіх різноманітних азотфіксаторах знаходиться та сама ферментна система, яка каталізує перетворення молекулярного азоту в аміак.

Це ферментний комплекс — нітрогеназа, яку вперше одержав Карнахан (1960) із сухих клітин Клострідіум пастеріанум в лабораторії фірми Дюпон в США. Встановлено, цо нітрогеназа складається з двох білків — азобілку (Fe-білок) та молібдобілок (Мо-Fе-білок). Перший з них має молекулярну масу (м. м.) 56000-67000, є димером, до складу його входить негемінове залізо, тобто залізо, зв'язане безпосередньо з сіркою білка. Другий, молібдобілок, тетрамер, має 4 субодиниці, м. м. 200 000 270 000, крім негемінового заліза має в своєму складі 2 атоми молібдену. В даний час виділено і досліджено обидва білки нітрогенази із ря­ду мікроорганізмів.

Для відновлення одного моля азоту потрібно 12-16 АТФ, тобто 4-5 АТФ на пару електронів, перенесену в процесі відновлення від відновника на азот. Насправді ж витрати енергії переви­щують ці величини і досягають до 30-40 молів АТФ на моль фіксованого азоту. Джерелом елек­тронів (фередоксини, флаводоксини) та АТФ служать процеси фотосинтезу, дихання та бродіння.

Для функціонування ферменту необхідно утворення комплексу між залізобілком та молібдозалізобілком у співвідношенні 1:1. Комплекс двох компонентів нітрогенази існує лише в період поєднаного з гідролізом АТФ перенесення електронів від азобілку до молібдену молібдобілку.

Слід пам'ятати, що фермент нітрогеназа руйнується (дезактивується) при контакті з О₂. Саме тому факультативні азотфіксатори фіксують азот лише в анаеробних умовах. Аеробним азотфіксаторам (азотобактер) для підтримання високої інтенсивності дихання та забезпечення синтезу АТФ потрібні значні витрати О₂. Саме тому, можливо, це і є перешкодою для надходження О₂ в центри азотфіксації, що не впливає на дію ферменту. Інша гіпотеза передбачає, що ймовірно захист нітрогенази здійснюють асоційовані з нею білки, зокрема, за рахунок конформаційних змін.

Вільноживучі ціанобактерії фіксують азот в гетероцистах, товста клітинна стінка яких захи­щає від доступу кисню. Симбіотичні ж організми для регуляції концентрації О₂ в зоні фіксації азоту мають специфічну систему — фітоглобін, який синтезує рослина-хазяїн. Він досить чут­ливий до О₂ і тому попереджає накопичення кисню. Будучи синтезованим клітиною рослини-хазяїна, він монтується в мембрану бактероїда і забезпечує транспортування О₂ до бактероїда, створюючи таким чином захисний ефект для нітрогенази.

Отже, бактероїд слід розглядати як високоспеціалізований компартмент, який створює сере­довище, де фіксація азоту та окислювальні процеси фізіологічно сумісні. Цикл Кребса, який функціонує в бактероїді, служить джерелом субстратів для окислення в ЕТЛ, що забезпечує син­тез АТФ, постачає нітрогеназу електронами через фередоксин та кетокислоти для утворення аміно­кислот, що транспортуються потім в клітини рослини-хазяїна.

Регуляція нітрогенази. Щодо витрати енергії нітрогеназу слід вважати економічно не вигідним ферментом, адже для підтримання її активності потрібна АТФ. Тому азотфіксуючі ор­ганізми виробили способи регуляції синтезу та активації нітрогенази.

Здатністю фіксувати азот керує набір генів, відомих як гени фіксації азоту (nif). Вільножи­вучі азотфіксатори синтезують аміак одночасно з процесами біосинтезів бактеріальної клітини, тому він практично засвоюється і не виділяється в навколишнє середовище. При наявності в грунті зв'язаного азоту (NH₄, NO₃), який може бути використаний для ростових процесів в клітині, nif-гени репресовані і нітрогеназа не утворюється.

Навпаки, в деяких бактерій-симбіонтів, наприклад Різобіум, nif-гени в нормі дерепресовані, в результаті чого нітрогеназа утворюється та зберігає свою активність навіть при наяв­ності амонію, а фіксований азот виділяється в цитоплазму клітин-хазяїна. В такій симбіотичній асоціації дерепресія nif-генів зумовлює фіксацію значних кількостей атмосферного азоту.