Ферменты для биологического очищения гнойно – некротических ран

В состав ферментных препаратов , применяемых для местного лечения гнойно – некротических процессов входят протеазы различного происхождения:

1. Животного – трипсин, химотрипсин, плазмин, дезоксирибонуклеаза, выделяемые из плазмы и поджелудочной железы крупного рогатого скота;

2. Растительного – папаин, получаемый из плодов папайи;

3. Микробного – коллагеназы, трипсинподобные протеазы, продуцируемые различными культурами микроорганизмов, например, Clostridium hystolyticum, Aspergillus tericoba.(12)

Выпускаются такие ферментные препараты в виде порошков, взвесей, мазей, а также ферменты, закрепленные на перевязочном материале.

Трипсин кристаллический, химотрипсин кристаллический, рибонуклеаза, дезоксирибонуклеаза, коллагеназа - ферментные препараты, получаемые из поджелудочной железы крупного рогатого скота; применяются местно и парентерально для разжижения вязких секретов, экссудатов с мокротой, сгустков крови при воспалительных заболеваниях дыхательных путей, тромбофлебитах и др., для расщепления некротизированных тканей при лечении ожогов, пролежней, гнойных ран и др.; выпускаются в виде стерильных порошков во флаконах и ампулах.(9)

Процесс получения Рибонуклеазы

Известны способы получения рибонуклеаз из микроорганизмов, включающие культивирование продуцентов на соответствующих питательных средах и очистку целевого продукта хроматографическими методами последовательно на нескольких сорбентах.

Недостатками этих способов являются многостадийность и низкий выход целевого продукта. Кроме того, применение микробных рибонуклеаз в качестве медицинских препаратов часто осложняется их иммуногенностью, обусловленной чужеродностью их для организма человека.

Наиболее близким к заявляемому способу по технической сущности, достигаемому результату и свойствам продукта прототипом является способ получения рибонуклеазы панкреатической аморфной, включающий следующие стадии:

измельчение поджелудочной железы крупного рогатого скота;

экстрагирование рибонуклеазы 0,25 н раствором серной кислоты, отделение экстракта от осадка;

высаливание балластных белков сульфатом аммония;

очистка рибонуклеазы с применением кизельгура;

повторная очистка солевым фракционированием, обработкой фенолом, ацетоном, этанолом;

получение готовой формы продукта.

Недостатками прототипа является:

низкий выход целевого продукта, составляющий 1 г рибонуклеазы из 1480 г поджелудочной железы;

сложность и многостадийность процесса;

использование легковоспламеняющихся и токсичных веществ (фенола, ацетона, этанола);

использование дефицитных импортных реагентов (кизельгур);

использование поджелудочной железы, являющейся ценным дефицитным сырьем для получения других препаратов (инсулина).

Технической задачей изобретения является упрощение известного способа получения рибонуклеазы панкреатической аморфной и увеличение выхода целевого продукта.

Для решения поставленной задачи в качестве исходного животного сырья используют спиртовой шрот поджелудочной железы, являющийся неутилизируемым в настоящее время отходом производства инсулина, а очистку рибонуклеазы панкреатической аморфной осуществляют ультрафильтрацией на полых волокнах с последующей обработкой активированным углем.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Рибонуклеазу панкреатическую экстрагируют из спиртового шрота поджелудочной железы 0,25 н раствором серной кислоты в соотношении 1:4 в течение 24 ч при перемешивании. Отделяют экстракт, содержащий рибонуклеазу, от шрота стандартными методами, Очищают рибонуклеазу ультрафильтрацией на полых волокнах с помощью установки УПЛ-6, скомплектованной аппаратами разделительными типа АР-2,0 (ТО 17 216.00.00.00). Для удаления пирогенных примесей очищенную РНКазу пропускают через колонку с гранулированным активированным углем. Полученный раствор рибонуклеазы панкреатической подвергают концентрированию, стерилизации, розливу и сушке стандартными методами, предусмотренными для лекарственных препаратов.(4)

Процесс получения Коллагеназы

Известен способ получения очищенной коллагеназы из коммерческого комплексного препарата протеолитических ферментов из гепатопанкреаса крабов Paralithodes Camtschatica . По предлагаемому автоpами методу после осаждения фермента сульфатом аммония коллагеназу отделяют с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе CL 6B ("Pharmacia", Швеция) с последующим диализом и лиофилизацией. Полученный препарат очищен в 40 раз.

К недостаткам способа следует отнести его неэкономичность вследствие использования дорогостоящего импортного сорбента, а также то, что в приведенном варианте способ является аналитическим, количественный выход не указан, процесс невозможно воспроизвести в условиях масштабного производства.

Известен также способ получения коллагеназ из гепатопанкреаса камчатского краба из препарата Дигестаза , включающий гель-фильтрацию на сефадексе G-75 ("Pharmacia"), ионообменную хроматографию на колонке с Моно-Q ("Pharmacia") в режиме FPLС, с последующими обессоливанием и лиофилизацией.

Способ также является аналитическим, количественный выход не указан, используются дорогие импортные сорбенты и оборудование. Степень очистки в 2-20 раз в зависимости от способа определения активности.

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ получения препарата из гепатопанкреаса краба Fiddler Crab, Uca pugilator путем гомогенизации сырья, осаждения комплекса ферментов сульфатом аммония и его очистки на ионообменном сорбенте. Способ включает следующие стадии: приготовление ацетонового порошка из гепатопанкреаса, центрифугирование, осаждение сульфатом аммония 70% насыщения рН 7,5 с добавлением 5 мМ CaCl2, центрифугирование, гель-фильтрация на сефадексе G-150 ("pharmacia", Швеция), хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, хроматография на гидроксиапатите, гель-фильтрация на сефадексе G-75, диализ с последующей лиофилизацией. Выход целевого продукта 7% . Степень очистки в 32 раза.

К недостаткам способа следует отнести использование дорогостоящих импортных реактивов и оборудования, трудоемкость процесса, многостадийность, незначительный выход целевого продукта.

Целью изобретения является упрощение и удешевление процесса, а также повышение выхода целевого продукта без уменьшения его удельной активности.

Это достигается тем, что гепатопанкреас крабов гомогенизируют, осаждают комплекс ферментов сульфатом аммония, который в отличие от прототипа подвергают очистке на аминированных силикатных материалах при рН 5,2-6,5, элюируя коллагеназу 1 М NaCl с 15-25% изопропанола при рН 7,0-8,5, а затем фермент выделяют из элюирующего раствора при насыщении его сульфатом аммония до 60% , достигая при этом дополнительной очистки.

Предлагаемый способ является более экономичным за счет использования аминированных силикатных материалов - аминосилохромов, аминоаэросилов, амино- силикагелей, выпускаемых отечественной промышленностью, что способствует значительному удешевлению процесса очистки. Кроме того, скорость протекания растворов через сорбенты на основе макропористых силикатов на порядок выше, чем в случае сорбентов на основе сефарозы и целлюлозы.

Повышение выхода целевого продукта достигается за счет сокращения времени очистки и числа стадий, т. к. коллагеназа может при длительном процессе разрушаться протеиназами, присутствующими в ферментном растворе. Проведение ионообменной хроматографии при рН 5,2-6,4 более целесообразно, чем при рН 7,5 (прототип), т. к. коллагеназы имеют изоэлектрические точки около рН 3,0, и проведение процесса в более низком интервале рН способствует более полной сорбции фермента из раствора.

Для дополнительной очистки и концентрации фермента коллагеназу высаливают из элюирующего раствора, насыщая его сульфатом аммония до 60% . Эта операция, не снижая выхода фермента, приводит к кристаллическому продукту.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем. В качестве источника коллагеназы используют гепато- панкреас промысловых видов краба, который гомогенизируют в 0,1 М ацетате аммония рН 6,4, содержащем 0,1-1,0 мМ ацетата кальция, отделяют экстракт центрифугированием, добавляют сульфат аммония 60-70% насыщения, осадок, содержащий коллагеназу, отделяют центрифугированием, растворяют в 0,1 М ацетате аммония рН 5,2-6,4 с добавлением 0,1-1,0 мМ Са2+. Затем наносят на макропористый кремнезем, содержащий ковалентно присоединенные алифатические аминогруппы, и промывают. Десорбцию проводят 1 М NaCl в присутствии 15-25% изопропилового спирта на буфере рН 7,0-8,5. Для усиления положительного эффекта к элюату, содержащему активный фермент, добавляют сульфат аммония до 60% насыщения. Слой, содержащий активную коллагеназу, отделяют, диализуют и лиофильно высушивают.

В результате получают очищенный ферментный препарат, обладающий коллагенолитической активностью, которую определяют известными методами. Выход 50% .(4)