34.2. Определение холестерина в крови методом тсх

Липиды, извлеченные из головного мозга в виде хлороформного экстракта, наносят на специально при­готовленный слой силикагеля, которым предварительно по­крывается стеклянная пластинка. Разделение глицеридов и общей фракции липидов производят в системе растворителей: гексан – диэтиловый эфир – ледяная уксусная кислота. Хроматограммы проявляют 10% спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты, пара­ми йода или концентрированной серной кислотой для обнару­жения веществ в виде окрашенных пятен.

Реактивы и материалы: биологический материал, свежеприготовленную смесь хлороформа и этанола (2:1), хлороформ, «свидетели» хлороформные растворы холестерина, моно-, ди- и триглицеридов, смесь растворителей гексан – диэтиловый эфир – уксусная кислота (73:25:2), 10% спиртовый раствор фосфорномолибденовой кислоты.

Оборудование и посуда: мерная колбочка на 25 мл с притертой пробкой, складчатый фильтр, воронка, выпаривательная чашка, электроплитка, капилляры, пластинки, хроматографическая камера, пульверизатор, сушиль­ный шкаф.

Порядок выполнения работы

1. Извлечение липидов из мозга. Для извлечения липидов из головного мозга 250 мг ткани помещают в мерную колбоч­ку на 25 мл с притертой пробкой, куда предварительно нали­вают свежеприготовленную смесь хлороформа и этанола (2:1). Содержимое колбы энергично перемешивают в тече­ние 3–5 минут, доводят хлороформ–метаноловой смесью до метки, снова перемешивают и через 5–10 минут фильтруют через складчатый фильтр. Полученный липидный экстракт упаривают досуха и осадок растворяют в, 1 мл хлороформа.

2. Нанесение экстракта на пластинки. Хлороформный экс­тракт липидов наносят с помощью капилляра на приготов­ленную пластинку на расстоянии 1 см от края пластинки. Про­бу наносят осторожным прикосновением капилляра так, чтобы слой силикагеля при этом не нарушался. После того как растворитель испарится, про­бу наносят еще раз. На той же стартовой линии на пластинку на расстоя­нии 1 см друг от друга наносят в качестве «свидетелей» хлороформные растворы холестерина, моно-, ди- и триглицеридов.

3. Установление пластинки в хроматографической камере. Пластинку помещают в камеру, куда предварительно наливают смесь растворителей, состоящую из гексана – диэтилового эфира – уксус­ной кислоты (73:25:2). Камера представляет со­бой стеклянный сосуд с подставкой для пластин­ки. Пластинку с нанесенным веществом устанавливают в ка­мере под углом в 10–15°, так чтобы нижний край пластинки с нанесенными пробами был погружен в жидкость приблизительно на 0,5 см. Разделение общей фракции липидов и глицеридов происходит в течение 50 минут при ком­натной температуре.

4. Проявление хроматограмм. По истечении указанного срока пластинку вынимают из камеры и высушивают на воз­духе в течение 30 минут. Хроматограммы проявляют, опры­скивая из пульверизатора 10% спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты. Опрыскивание хроматограммы проводят в стеклянном кол­паке диаметром 20–30 см и высотой 40–60 см, уста­новленном с наклоном 5–10°.

Опрыскиваемую пла­стинку помещают на стек­лянной подставке высотой в 10 см. Колпак закрыва­ют стеклом. В отверстие, просверленное в стекле, вставляют кончик пульве­ризатора и струю опрыскивающей жидкости направ­ляют под пластинку. При опрыскивании в камере со­здается устойчивый туман, при котором достигается хорошее проявление пятен без нарушения слоя сорбента. После опрыскивания кислотой пластинку нагревают до 80–100° в сушиль­ном шкафу. На желтом фойе проявляются пятна, окрашенные в синий цвет.

На хроматограмме обнаруживаются 8 пятен. В первом пятне у старта находятся фосфолипиды; второе пятно неидентифицировано; в третьем пятне содержится холесте­рин; четвертое пятно принадлежит моноглицеридам; пятое – диглицеридам; шестое – свободным жирным кислотам, седьмое – триглицеридам и, наконец, в восьмом пятне содержатся эфиры холестерина.