29.2. Определение содержания гликогена в печени

В пробирку молибденового стекла (или стекла пирекс) раз­мером 20 x 160 мм помещают навеску 1,00 г тщательно измель­ченной печени, добавляют 3 мл 30%-ного раствора едкого кали и нагревают на сильно кипящей водяной бане в течение 20 мин. По истечении этого времени пробирку охлаждают в холодной во­де, содержимое пробирки количественно переносят в мерную колбу и доводят объем дистиллированной водой до метки. Ем­кость мерной колбы подбирают в зависимости от возможного со­держания гликогена в печени: если анализируют печень только что убитого животного, измельченную при охлаждении, то вы­бирают колбу на 200–600 мл; для анализа печени, хранив­шейся длительное время, берут колбу на 25–50 мл.

Цветную реакцию с антроном и измерение проводят так же, как при определении содержания гликогена в мышечной ткани.

Работа № 30. Количественное определение нуклеиновых кислот

30.1. Определение суммарного количества нуклеиновых кислот

Метод определения суммарного количества нуклеиновых кислот основан на определении разностей оптической плотности (метод ∆), применяемый для уменьшения влияния различных примесей в исследуемых экстрактах.

При использовании этого метода в основу расчетов берут не .абсолютные величины оптических плотностей, а разность между оптической плотностью при 270 ммк и оптической плотностью при 290 ммк (D₂₇₀–D₂₉₀ = ∆D₂₇₀). Предварительно на гидролизатах стандартных препаратов дрожжевой РНК и тимусовой ДНК было найдено, что ∆D₂₇₀ равна 0,19.

Метод состоит из следующих операций: экстракция нуклеино­вых кислот хлорной кислотой, центрифугирование экстракта, из­мерение на спектрофотометре в ультрафиолете.

Реактивы и материалы: навеска ткани (5–500 мг), 0,5 н. хлорная кислота (НClО₄),

Оборудование и посуда: водяная баня, центрифуга, спектрофотометр.

Порядок выполнения работы

Навеску ткани (5–500 мг) заливают точно отмеренным количеством (5–10 мл) 0,5 н. хлорной кислоты (НClО₄) и нагревают в кипящей водяной бане 20 мин. После охлаждения и центрифугирования надосадочную жидкость используют для измерения поглощения в ультрафиолете на спектрофотометре СФ-4 непо­средственно (в случае малых количеств определяемого вещества) или после соответствующего разведения в 0,5 н. хлорной кислоты.

Измерение на спектрофотометре производят при 270 ммк и 290 ммк в отношении контрольного раствора (чистая 0,5 н. хлор­ная кислота). Если измерение производили в односантиметровых кварцевых кюветах, то расчет производят следующим образом: разность между оптической плотностью при 270 ммк и оптиче­ской плотностью при 290 ммк делят на 0,19 и получают количест­во микрограммов нуклеинового фосфора в 1 мл испытуемого раствора.

Для пересчета количества нуклеинового фосфора на количе­ство нуклеиновой кислоты пользуются средним пересчетным ко­эффициентом 10,3.

Метод дает возможность определять содержание нуклеиновой кислоты также в том случае, когда в изучаемом материале содер­жится только РНК или только ДНК.

Для пересчета с содержания фосфора на содержание РНК пользуются коэффициентом 10,5, а на содержание ДНК–10,1, исходя из теоретического содержания фосфора – 9,5 в РНК и 9,9 в ДНК.

Рекомендуется производить дополнительное контрольное из­мерение при 260 ммк. Оптическая плотность при 260 ммк должна быть приблизительно равна оптической плотности при 270 ммк (в пределах ±15%). Отклонение от последней больше чем на ±15% указывает на наличие большого количества мешающих примесей нуклеиновой природы. В этом случае иногда помотает предварительная отмывка навески материала на холоду 0,2 н. раствора хлорной кислоты.