- •Биохимия лабораторный практикум
- •Часть 1
- •Протокол №___
- •Биохимия лабораторный практикум
- •Пояснительная записка
- •Оформление лабораторного журнала
- •Лабораторная посуда и оборудование для биохимических исследований
- •Мытье лабораторной посуды
- •Лабораторное Оборудование
- •Подготовка воды для клинико-биохимических исследований
- •Общие правила работы с наборами для клинико-биохимических исследований
- •Калибровка мерной посуды
- •Применение международной системы единиц (си) в биохимической лабораторной практике
- •Методы расчета экспериментальных данных
- •Приготовление и исследование образцов
- •Экстр акция бав из растительных тканей
- •Приготовление гомогената из растительных тканей
- •Получение плазмы и сыворотки крови
- •Приготовление гомогената из тканей животных
- •Методики подготовки фав исследуемых образцов
- •Раздел 1 работа № 1. Цветные реакции на белки и аминокислоты
- •1.1. Биуретовая реакция (реакция Пиотровского)
- •Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы или пипетки. Порядок выполнения работы
- •1.2. Реакция Миллона
- •Порядок выполнения работы
- •1.3. Ксантопротеиновая реакция (Мульдера)
- •Порядок выполнения работы
- •1.4. Реакция Адамкевича
- •Порядок выполнения работы
- •1.5. Реакция Шульце-Распайля
- •Порядок выполнения работы
- •1.6. Реакция Фоля
- •Порядок выполнения работы
- •1.7. Нингидриновая реакция (реакция Руэманна)
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •1.8. Реакция с формальдегидом
- •Порядок выполнения работы
- •Работа №2. Реакции осаждения белков
- •2.1. Реакции осаждения белков при нагревании
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •2.2. Осаждение белков солями тяжёлых металлов
- •Реактивы и материалы: раствор яичного белка или разбавленная сыворотка крови, сернокислая медь, 5% раствор, уксуснокислый свинец, 5% раствор, азотнокислое серебро, 3% раствор.
- •Порядок выполнения работы
- •2.3. Осаждение белков алкалоидными реактивами
- •Порядок выполнения работы
- •2.4. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами
- •Порядок выполнения работы
- •2.5. Осаждение белков органическими кислотами
- •Порядок выполнения работы
- •2.6. Осаждение белков органическими растворителями
- •Порядок выполнения работы
- •2.7. Осаждение белков фенолом
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •2.8. Отделение альбуминов от глобулинов в сыворотке крови методом высаливания сернокислым аммонием и хлористым натрием
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •Работа №3. Макромолекулярная природа белка
- •Сопоставление молекулярного веса гемоглобина и рибофлавина
- •Порядок выполнения работы
- •3.2. Диализ белка
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •3.3. Хроматография аминокислот на бумаге
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •Работа № 4. Сложные белки
- •4.1. Нуклеопротеины
- •4.1.1. Кислотный гидролиз нуклеопротеинов дрожжей и определение их состава
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •4.1.2. Изучение химического состава рибонуклеопротеинов дрожжей
- •Порядок выполнения работы
- •4.2. Хромопротеины
- •4.2.1. Открытие железа в гемоглобине
- •Порядок выполнения работы
- •4.2.2. Получение кристаллов гемина (Тейхмана)
- •Порядок выполнения работы
- •4.3. Фосфопротеины
- •4.3.1. Гидролиз казеина и открытие в гидролизате белкового компонента и фосфорной кислоты
- •Порядок выполнения работы
- •4.4. Гликопротеины
- •4.4.1. Выделение муцина и реакции на его белковую часть и углеводную группировку
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •4.4.2. Реакция с азотной кислотой
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 5. Свойства ферментов
- •5.1. Гидролиз крахмала α-амилазой слюны
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •5.2. Термолабильность α-амилазы слюны
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •5.3. Специфичность α-амилазы слюны и сахарозы дрожжей
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •5.4. Влияние рН на активность α-амилазы слюны (определение оптимума рН для действия амилазы)
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •5.5. Влияние активаторов и ингибиторов на активность α-амилазы слюны
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •Порядок выполнения работы
- •5.6.3. Установление термолабильности уреазы
- •Порядок выполнения работы
- •5.7. Исследование ферментативной активности липазы
- •5.7.1. Исследование действия липазы на липиды животного происхождения
- •Порядок выполнения работы
- •5.7.2. Исследование действия липазы на липиды растительного происхождения
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 6. Определение ферментативной активности
- •6.1. Определение активности -амилазы по Вольгемуту
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •6.2. Определение активности каталазы крови по Баху и Зубковой
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола.
- •Работа № 7. Витамины. Качественный анализ витаминов
- •7.1. Витамин в1 (тиамин, анейрин)
- •Реакция окисления витамина в1 в тиохром (2,7-диметилтиохромин-8-этанол)
- •Порядок выполнения работы
- •7.2. Витамин в2 (рибофлавин)
- •Реакция восстановления витамина в2
- •Порядок выполнения работы
- •7.3. Витамин Вб (пиридоксин, адермин)
- •Реакция витамина Вб с хлорным железом
- •Порядок выполнения работы
- •7.4.Витамин в12 (цианкобаламин, антианемический)
- •Открытие кобальта, содержащегося в витамине в12, реакцией с тиомочевиной
- •Порядок выполнения работы
- •7.5. Витамин рр (никотинамид, антипеллагрический)
- •7.5.1. Качественная реакция на никотиновую кислоту с уксуснокислой медью
- •7.6.1. Реакция на витамин с железосинеродистым калием
- •Порядок выполнения работы
- •7.6.2. Качественная реакция на витамин с с метиленовой синью
- •Порядок выполнения работы
- •7.6.3. Качественная реакция на витамин с с 2,6-дихлорфенолиндофенолом
- •Порядок выполнения работы
- •7.7. Витамин а (ретинол)
- •7.7.1. Открытие витамина а в рыбьем жире с концентрированной серной кислотой
- •Порядок выполнения работы
- •7.7.2. Открытие каротина в шиповнике и обнаружение в нем ненасыщенных связей
- •Порядок выполнения работы
- •7.8. Витамин d (кальциферол, антирахитический)
- •Обнаружение витамина d в рыбьем жире с анилиновым реактивом
- •Порядок выполнения работы
- •7.9. Витамин е (токоферолы, витамин размножения)
- •Качественная реакция на витамин е с концентрированной азотной кислотой
- •Порядок выполнения работы
- •7.10. Витамин к (филлохинон, антигеморрагический)
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •Работа № 8. Количественный анализ витаминов
- •8.1. Определение витамина с йодометрическим методом
- •Порядок выполнения работы
- •8.2. Количественное определение витамина р (рутина) в чае
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 9. Углеводы
- •9.1. Хроматографический анализ углеводов
- •Порядок выполнения работы
- •9.2. Реакции на открытие углеводов. Свойства углеводов
- •9.2.1. Реакция «серебряного зеркала»
- •Порядок выполнения работы
- •9.2.2. Реакция Селиванова (открытие фруктозы)
- •Порядок выполнения работы
- •9.2.3. Проба Бенедикта на глюкозу
- •Порядок выполнения работы
- •9.2.4. Реакция Молиша
- •Порядок выполнения работы
- •9.2.5. Цветная реакция с ванилином на фруктозу
- •9.2.8. Проба Гайнеса
- •Порядок выполнения работы
- •9.2.11. Реакция с тимолом
- •Порядок выполнения работы
- •9.2.12. Восстанавливающая способность лактозы
- •Порядок выполнения работы
- •9.2.13. Отсутствия восстанавливающей способности сахарозы
- •Порядок выполнения работы
- •9.2.14. Растворение целлюлозы в медноаммиачном растворе
- •Порядок выполнения работы
- •9.2.15. Взаимодействие полисахаридов с йодом
- •Порядок выполнения работы
- •9.2.16. Действие на углеводы реактива Фелинга
- •Порядок выполнения работы
- •9.3. Йодометрический метод определения лактозы
- •Порядок выполнения работы
- •Расчёт результатов
- •Работа № 10. Выделение и анализ гликогена
- •10.1. Выделение гликогена из дрожжей
- •Порядок выполнения работы
- •Расчёт результатов
- •11.1. Липиды и их обмен
- •11.1.1. Открытие непредельных жирных кислот
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •11.1.2. Эмульгирование жиров
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •11.1.3. Влияние желчных кислот на активность панкреатической липазы
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •11.1.4. Роль сывороточного альбумина в транспорте высших ук ирных кислот в крови
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •11.2. Фосфолипиды
- •11.2.1. Определение общих фосфолипидов в сыворотке крови по фосфору
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •11.2.2. Обнаружение фосфатидилхолина в желтке куриного яйца
- •Порядок выполнения работы
- •11.3. Стерины (стеролы) и стериды
- •11.3.1. Открытие холестерина в тканях головного мозга
- •Порядок выполнения работы
- •11.3.2. Количественное определение общего холестерина в сыворотке крови прямым методом по реакции Златкис– Зака
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендации к составлению протокола
- •Работа № 12. Показатели липидов. Химические свойства липидов
- •12.1. Показатели липидов
- •12.1.1. Количественная оценка степени ненасыщенности липидов по йодному числу
- •Порядок выполнения работы
- •12.1.2. Обнаружение перекисных соединений
- •Порядок выполнения работы
- •12.1.3. Количественное определение перекисного числа
- •Порядок выполнения работы
- •12.1.4. Определение кислотного числа
- •Порядок выполнения работы
- •12.2.2. Получение калиевого жидкого мыла
- •Порядок выполнения работы
- •12.2.3. Определение содержания жирных кислот в твердом мыле
- •Порядок выполнения работы
- •Порядок выполнения работы
- •12.2.7. Обнаружение стеролов в растительном масле
- •Порядок выполнения работы
- •Раздел 2 работа № 13. Исследование ферментов дыхательной цепи
- •13.1. Исследование действия каталазы крови
- •Порядок выполнения работы
- •13.2. Качественное определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 14. Окислительное фосфорилирование
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 15. Моделирование биологических окислительно-восстановительных систем
- •15.1. Сопоставление редокс-потенциалов рибофлавина и метиленового синего
- •Порядок выполнения работы
- •15.2. Обнаружение дегидрогеназ лимоннокислого цикла
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 16. Переваривание углеводов в желудочно-кишечном тракте
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 17. Метаболизм липидов
- •17.1. Открытие непредельных жирных кислот в жире
- •Порядок выполнения работы
- •17.2. Эмульгирование липидов
- •Порядок выполнения работы
- •17.3. Качественные реакции на желчные кислоты
- •Порядок выполнения работы
- •17.4. Роль сывороточного альбумина в транспорте высших жирных кислот в крови
- •Порядок выполнения работы
- •17.5. Определение общих фосфолипидов в сыворотке крови по фосфору
- •Порядок выполнения работы
- •17.6. Открытие холестерина в тканях головного мозга
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 18. Переваривание жиров липазой поджелудочного сока
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 19. Обмен белков
- •19.1. Переваривание белков пепсином
- •Порядок выполнения работы
- •19.2. Переваривание белков ферментами поджелудочной железы
- •Порядок выполнения работы
- •Работа №20. Анализ желудочного сока
- •20.1. Титрование кислот желудочного содержимого
- •Порядок выполнения работы
- •Пример расчета
- •20.2. Колориметрический метод определения протеолитической активности поджелудочного сока
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 21. Исследование гормонов различных классов
- •21.1. Гормон поджелудочной железы — инсулин
- •Порядок выполнения работы
- •21.2. Гормоны щитовидной железы
- •Порядок выполнения работы
- •21.3. Гормон мозгового слоя надпочечников – адреналин
- •Порядок выполнения работы
- •21.4. Гормоны коркового слоя надпочечников (кортикостероиды)
- •Порядок выполнения работы
- •21.5. Гормоны половых желез
- •Образование фенолята фолликулина
- •Реакция на фенольную группу
- •Работа № 22. Минеральный обмен
- •22.1. Определение фосфатов
- •22.1.1. Определение неорганического фосфора в сыворотке крови по восстановлению фосфорно-молибденовой кислоты
- •Порядок выполнения работы
- •22.1.2. Определение фосфатов в слюне
- •Порядок выполнения работы
- •22.2. Определение кальций
- •Порядок выполнения работы
- •22.3. Обнаружение роданидов в слюне
- •Порядок выполнения работы
- •22.4. Определение кальция и фосфора в ткани зуба
- •Порядок выполнения работы
- •22.5. Исследование минерального состава кости
- •22.5.1. Реакция на кальций
- •Порядок выполнения работы
- •22.5.2. Реакция на магний
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 23. Биохимия мышечного сокращения
- •23.1. Разделение белков мышечной ткани
- •Порядок выполнения работы
- •23.2. Ферменты мышечной ткани
- •Порядок выполнения работы
- •23.3. Экстрактивные вещества мышечной ткани
- •Порядок выполнения работы
- •23.4. Минеральные вещества мышечной ткани
- •Порядок выполнения работы
- •23.5. Получение и исследование свойств желатины из сухожилий
- •Порядок выполнения работы
- •23.6. Обнаружение молочной кислоты
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 24. Биохимия печеночной ткани
- •Тимоловая проба (нтк «Анализ-х») (уирс)
- •Порядок выполнения работы
- •Раздел 3 работа № 25. Рн и буферные системы
- •25.1. Лимонно-фосфатная буферная смесь. Приготовление растворов
- •Порядок выполнения работы
- •25.2. Определение рН исследуемого раствора универсальным индикатором
- •Порядок выполнения работы
- •25.3. Свойства буферных растворов
- •Порядок выполнения работы
- •25.4. Приготовление буферного раствора и определение его буферной емкости
- •25.4.1. Приготовление ацетатного буфера
- •Порядок выполнения работы
- •25.4.2. Определение буферной емкости раствора по щелочи
- •Порядок выполнения работы
- •Работа №26. Определение общего азота методом кьельдаля
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 27. Рефрактометрическое определение концентрации белков в сыворотке крови
- •Порядок выполнения работы
- •Работа №28. Определение общего фосфора в тканях
- •Порядок выполнения работы
- •Работа №29. Определение содержания гликогена
- •29.1. Определение содержания гликогена в мышечной ткани Порядок выполнения работы
- •29.2. Определение содержания гликогена в печени
- •Работа № 30. Количественное определение нуклеиновых кислот
- •30.1. Определение суммарного количества нуклеиновых кислот
- •Порядок выполнения работы
- •30.2. Определение нуклеиновых кислот в крови (по п. В. Симакову)
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 31. Газохроматографическое определение спирта в крови
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 32. Газохроматографическое определение лекарственных препаратов
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 33. Прямое атомно-абсорбционное определение 3d-элemehtob (Fe, Сu, Mn, Co, Ni) и Zn в биологическом материале
- •Порядок выполнения работы
- •Работа № 34. Определение веществ методом тсх
- •34.1. Определение углеводов в крови методом тсх
- •34.1.1. Открытие сахароз по Барону и Экономидису в моче
- •Порядок выполнения работы
- •34.1.2. Количественное определение сахароз по Банхеру
- •Порядок выполнения работы
- •34.2. Определение холестерина в крови методом тсх
- •Порядок выполнения работы
- •Рекомендуемая литература основная
- •Дополнительная литература
- •Содержание
- •Раздел 1 18
- •Раздел 2 100
- •Раздел 3 135
Общие правила работы с наборами для клинико-биохимических исследований
При работе с биохимическими наборами для того, чтобы избежать наиболее распространенных ошибок, необходимо придерживаться следующих общих правил:
1. Тщательно изучить инструкцию по применению набора и пунктуально ей следовать, выполняя все рекомендации по условиям хранения компонентов набора и раствора рабочего реагента (температура, тара, время, освещение), а также по условиям проведения анализа (температура, последовательность добавления реагентов, время реакции и т.д.).
Не использовать наборы, если герметичность их упаковки нарушена или внешний вид не соответствует паспортным данным.
Наборы с истекшим сроком годности необходимо проверить на правильность определения по контрольным сывороткам. Если определенное вами содержание компонента соответствует паспортным данным контрольной сыворотки, то набор можно использовать. Без проверки использовать просроченные наборы нельзя.
Посуду для приготовления раствора рабочего реагента и пробирки для проведения анализа промыть либо с помощью хромовой смеси (хромпика), либо с помощью моющих средств, не содержащих биодобавки, тщательно прополоскать водопроводной, а затем дистиллированной водой и просушить в сушильном шкафу. Каждый раз для приготовления раствора рабочего реагента брать чистую посуду, не использовать посуду, пробирки, пипетки и наконечники для автоматических дозаторов повторно.
Использовать только дистиллированную, свежеперегнанную, прокипяченную, охлажденную воду.
Растворы рабочих реагентов из общей склянки (колбы, флакона) отлить в другую склянку (колбу, флакон) в количестве, необходимом на один рабочий день, и пользоваться ими, а не отбирать пипеткой многократно из общей склянки.
Использовать автоматические дозаторы для отбора проб сыворотки, калибратора, а также раствора рабочего реагента. Дозаторы необходимо регулярно, не менее одного раза в год, поверять.
Для измерения оптической плотности использовать кюветы с толщиной поглощающего свет слоя жидкости 1 см, если не указано специально, что можно использовать кюветы меньшей толщины. Объем помещаемого в кювету исследуемого раствора должен быть достаточным, чтобы луч света проходил ниже уровня жидкости.
При проведении анализа для инкубации проб следует использовать водяной термостат. Если все-таки приходится использовать воздушный термостат, то необходимо увеличить время прогрева рабочего раствора перед началом реакции с 5 минут до 10–15 минут.
Все растворы рабочих реагентов и других реагентов, готовых к использованию, после отбора реагента следует плотно закрыть и держать закрытыми.
Предельно внимательно и аккуратно следует работать с калибратором. Нельзя определять самим концентрацию калибратора или разбавлять его, чтобы получить более низкую концентрацию. Для отбора калибратора следует использовать только новые наконечники.
При внесении пробы в реакционную смесь, особенно если ее объем составляет 5–10 мкл, необходимо следить, чтобы проба не осталась на стеклах пробирки или кончике пипетки. Смесь после внесения пробы следует тщательно перемешать, не допуская при этом вспенивания.
В процессе растворения реагентов, содержащих ферменты, нельзя допускать вспенивания, так как это может привести к их инактивации.