Работа № 34. Определение веществ методом тсх

34.1. Определение углеводов в крови методом тсх

При изучении патологических состояний, сопровождающихся нарушениями углеводного обмена, сталкиваются с проблемой идентификации углеводовв биологических жидкостях. В первую очередь речь идет о состояниях, при которых происходит чрезмер­ное выделение глюкозы, галактозы, фруктозы и пентоз. Детальное обсуждение с биохимической точки зрения показывает, насколько важную информацию о характере изменений метаболизма углеводов можно получить с помощью хроматографических методов.

34.1.1. Открытие сахароз по Барону и Экономидису в моче

Реактивы и материалы: силикагель, 0,1 М борная кислота, биологические пробы, система н-бутанол – уксусная кислота (1:1), анилиновый реактив.

Анилиновый реактив: 1 г анилина и 1 г дифениламина в 100 мл ацетона. 10 мл этого раствора перед употреблением смешивают с 1 мл 85%-ной фосфор­ной кислоты. Хроматограммы нагревают при температуре 120°С; окрашивание появляется через 5 мин.

Оборудование и посуда: пластинки, сушильный шкаф, шприц, хроматографическая камера, пульверизатор.

Порядок выполнения работы

Приготовление слоя. 1 часть силикагеля G смешивают с 2 частями 0,1 М борной кислоты. После нанесения на пластинки слой сушат 2 ч при комнатной температуре и затем 30 мин при 105°С.

Нанесение проб и хроматографирование. После нанесения 5 мкл исследуемой мочи и 5–10 мкг эталона хроматографируют до расстояния 12–15 см при 37 °С в системе н-бутанол – уксусная кислота (1:1).

Обнаружение. После сушки хроматограммы сахара обнаруживают опрыскиванием анилиновым реактивом.

Значения R_F углеводови окраска пятен под действием анилинового реактива

Сахар	hRF	Окрашивание	Сахар	hRF	Окрашивание
Лактоза	7	Сине-серое	Фруктоза	21	Коричневое
Сахароза	16	Коричнево-серое	Глюкоза	28	Мальвово-серое
Галактоза	19	Мальвово-серое	Ксилоза	31	Синее

34.1.2. Количественное определение сахароз по Банхеру

Реактивы и материалы: силикагель, дистиллированная вода, биологические пробы, смесь этилацетат – ацетон – вода (40:50:10), смесь н-бутанол – уксусная кислота – эфир – вода (45:30:15:5), анилиновый реактив.

Оборудование и посуда: пластинки, сушильный шкаф, шприц, хроматографическая камера, пульверизатор.

Порядок выполнения работы

Приготовление слоя. 30 г силикагеля G смешивают с 65 мл дистиллированной воды и после нанесения на пластинки слой сушат в течение ночи при комнатной температуре. Так получаются более воспро­изводимые результаты, чем при сушке слоя при повышенной температуре.

Хроматографирование. Образец наносят на старт в углу пластинки на расстоянии 1,5 см от краев. В первом направлении элюируют смесью этилацетат – ацетон – вода (40:50:10), пока фронт не пройдет расстояние 15–18 см. После высушивания во втором направлении пользуются смесью н-бутанол – уксусная кислота – эфир – вода (45:30:15:5).

Обнаружение. Сахара или их производные обнаруживают анилиновым реактивом – после опрыскивания хроматограмму сушат 10–15 мин при 80 – 100 °С и окраску пятен наблюдают в видимом.

Сорбент: силикагель G;

системы: первое направление – этилацетат – ацетон – вода (40:50:10), второе направление – н-бутанол – уксусная кислота – эфир – вода (45:30:15:5);

обнаружение: анилиндифениламиновый реактив. 1 – глюкоза; 2 – арабиноза; 3 – рибоза; 4 – ксилоза; 5 – эритроза; 6 – глицериновый аль­дегид; 7 – гликолевый альдегид; 8 – диоксиацетон; 9 – метилглиоксаль; 10 – глиоксаль; 11 – редуктон.

Сыворотка крови. Сыворотку освобождают от белка добавлением пикриновой кислоты (75 мг/л). Окрашенную в желтый цвет жидкость после центрифугирования хроматографируют. Если в распоряжении имеется достаточное количество исследуемого материала, можно затем подвергнуть пробу обессоливанию так, как делают с мочой.