20.2. Колориметрический метод определения протеолитической активности поджелудочного сока

Для определения протеолитического активности поджелудочного сока используют метод, основанный на количественном определении продуктов расщепления белка (аминокислот, пептидов и др.) под влиянием поджелудочного сока. Так называемый тирозиновый метод определения – протеолитической активности, поджелудочного сока основан на определении тирозина, образующегося в результате переваривания белков сыворотки или плазмы крови, количество, которого прямо пропорционально активности протеолитических ферментов (трипсина, химотрнисина). Тирозин с фенольным реактивом дает синее окрашивание, интенсивность которого определяется на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром. В качестве субстрата в данной работе используется сухая плазма крови крупного рогатого скота.

Реактивы и материалы: вода, раствор сухой плазмы крови, разведенный поджелудочный сок, трихлоруксусная кислота, 0,5 н. раствор NaOH, фенольный реактив.

Оборудование и посуда: пробирки, пипетки, термостат, стеклянные палочки, фильтровальная бумага, вороки, фотоэлектроколориметр с красным светофильтром.

Порядок выполнения работы

В опытную и контрольную пробирки наливают по 5 мл 2,5% раствора сухой, плазмы крови, в третью про­бирку наливают 3 мл разведенного поджелудочного сока. Все три пробирки помещают в термостат при 38° на 10 минут.

После прогревания в опытную и контрольную пробирки из третьей пробирки наливают по 1 мл разведенного поджелудочного сока, а в контрольную пробу добавляют еще 10 мл трихлоруксусной кислоты. Пробы быстро перемешивают и, отметив время, помещают в термостат.

Через 20 минут в опытную пробирку приливают 10 мл трихлоруксусной кислоты, перемешивают и затем фильтруют.

В фильтрате проводят определение образовавшегося тирозина. Для этого в две другие пробирки наливают по 10 мл 0,5 н. раствора NaOH, по 5 мл фильтрата, соответственно из опытной и контрольной проб, по 1 мл фенольного реактива и быстро перемешивают. Появляется синее окрашивание, постенно усиливающееся между 20-й и 40-й минутами. В этом промежутке и определяется интенсивность окраски на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром.

Разность между оптической плотностью опытной и контрольной проб соответствует величине прироста тирозина под влиянием ферментативного гидролиза белков плазмы.

Количество тирозина определяют пи калибровочной, кривой, которая строится по стандартным растворам тирозина, содержащим 0,5—1,0—1,5 мг тирозина (исходная концентрация — 1 мг тирозина в 5 мл раствора). Ни оси абсцисс откладывают концентрации тирозина, на оси ординат — соответствующие показания оптических плотностей.

Работа № 21. Исследование гормонов различных классов

Гормоны принадлежат к различным классам органи­ческих соединений, синтезируемых в эндокринных же­лезах или железах внутренней секреции. Это биологи­чески активные вещества, оказывающие регуляторное влияние на обмен веществ.

21.1. Гормон поджелудочной железы — инсулин

Инсулин образуется в (i-клетках островков Лангерганса из своего предшественника — проинсулииа. По химической природе он является белком. Полипептидные цепи соеди­нены в двух точках дисульфидными мостиками. Инсулин дает почти все характерные цветные реакции на белок.

Реактивы и материалы: препарат инсулина в ампулах (можно использовать в разведении 1:100), NaOH, 10%-ный раствор; CuSO₄, 1%-ный раствор; реактив Миллона; ацетат свинца, 5%-ный раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками; пипетки.