Порядок выполнения работы

В две пробирки отмеривают по 3 мл фосфатного бу­фера с рН 7,4. В одну (опытную) пробирку добавляют 5 капель 5% раствора янтарной кислоты и (для нейтра­лизации) 5 капель 0,1 н раствора гидроксида натрия, в другую (контрольную) приливают 10 капель дистиллированной воды. В обе пробирки добавляют по 1 мл 0,001 N раство­ра 2,6-дихлорфенолиндофенола и по 50 мг хорошо из­мельченной ткани поперечнополосатых мышц только что убитого животного. Обе пробирки помещают на 20 минут в термостат при 37 °С. Сравнивают интенсивность окраски в контрольной и опытной пробирках.

Сделать выводы.

Работа № 14. Окислительное фосфорилирование

В печени содержатся ферменты, при участии которых происходит фосфоролиз гликогена и дальнейшее превращение его до стадии образования фосфоглицериновой кислоты. Этот процесс может протекать в атмосфере азота и в атмосфере кислорода в присутствии фторида натрия. Если процесс протекает в атмосфере азота, в среде накапливается НАДНН⁺. Если процесс превращения гликогена происходит в атмосфере кислорода, то образовавшийся НАДНН⁺ окисляется при участии ферментов митохондриальной дыхательной цепи с образованием НАД и Н₂О. При окислении НАДНН⁺ образуются 3 молекулы АТФ.

Убыль минерального фосфата под влиянием фермен­тов, содержащихся в печени, в атмосфере кислорода про­текает более интенсивно, чем в атмосфере азота.

Реактивы и материалы: измельченная печень, фосфатный буфер рн 8,2, трихлоруксусная кислота, 5% раствор, молибденовокислый аммоний, 2,5% раствор, раствор эйконогена и сульфата натрия, фтористый натрий, 1% раствор, серная кислота, 5 n раствор, крахмал, 1% раствор.

Оборудование и посуда: термостат, ножницы, пинцет, фарфоровая ступка, химические стаканчики на 25 мл, весы технические или роговые, битое стекло, измельченное до порошка, шприцы без иглы, воронки, пипетки глазные, пробирки или склянки с притертыми пробками на 10 мл, газометр, заполненный кислородом, или кислородная подушка, газометр, заполненный азотом, лед.

Порядок выполнения работы

На технических весах взвешивают навеску печени, записывают ее вес, затем помещают печень в фарфоровую ступку, стоящую на льду. Печень измельчают ножницами, добавляют немного битого стекла и растирают пестиком до получения однородной массы. После этого постепенно добавляют М/30 фосфатный буфер с рН 8,2 в количестве, равном весу печени. Содержимое ступки продолжают размешивать пестиком и добавляют 2 кап­ли 1% раствора фтористого натрия. Полученную массу оставляют на несколько минут в ступке, чтобы осело стекло, затем часть вытяжки сливают в стеклянный ста­канчик, стоящий на льду.

В 4 пробирки с притертыми пробками отмеривают при помощи шприца без иглы по 10 капель вытяжки из печени, приливают туда по 10 капель М/30 фосфатного буфера с рН 8,2, по 5 капель 1% раствора крахмала и добавляют по 1 капле фторида натрия. В 2 пробирки (контрольные) добавляют по 10 капель 5% раствора трихлоруксусной кислоты для денатурации ферментов. Помещают в штатив одну контрольную и одну опытную пробирки и пропускают через них кислород в течение 5 минут. В другой штатив также помещают контрольную и опытную пробирки и пропускают через них азот в те­чение 5 минут. Все четыре пробирки закрывают притертыми пробками и помещают в термостат при 38° на 30 минут. После этого в опытные пробирки добавляют по 10 капель 5% раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают. Содержимое всех пробирок фильтруют в чистые пронумерованные пробирки через влажные бумажные фильтры, помещенные в воронки. В пробирках с фильтрами проводят цветную реакцию на фосфор: добавляют в каждую пробирку по 10 капель молибдата (смесь равных объемов 2,5% раствора молибденовокислого аммония и 5N раствора серной кис­лоты) и 5 капель смеси растворов эйконогена и суль­фата натрия. Помещают пробирки в термостат на 10 минут. Наблюдают развитие синей окраски, получае­мой в результате реакции неорганического фосфата с мо­либденовым реактивом. Сравнивают визуально интенсив­ность окраски в контрольных и опытных пробирках, термостатировавшихся в атмосфере кислорода и в атмо­сфере азота. Отмечают, в какой из опытных пробирок более интенсивно произошла эстерификация неорганиче­ского фосфата — в атмосфере кислорода или в атмосфе­ре азота.

Делают выводы.

Примечание. При отсутствии эйконогена его можно заменить 1% раствором гирохинона 0,5 мл и 2 мл карбонатсульфитной смесью следующего состава: 40 г безводного карбоната натрия в 200 мл воды и 7,5 г сульфита натрия в 50 мл воды с последующим смешиванием растворов.