Порядок выполнения работы

1. В центрифужную пробирку помещают 3 мл дистиллированной воды и наливают 0,2 мл сыворотки крови. Добавляют 3 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, первые 1,5 мл по каплям, встряхивая пробирку, остальные — быстрее. Оставляют стоять 1—2 минуты.

2. Через 1—2 минуты содержимое пробирки центрифугируют 3-5 минут. Надосадочную жидкость сливают и переворачивают пробирку, пока не стечет вся жидкость.

3. К полученному осадку прибавляют 1 мл 57% раствора хлорной кислоты и 1—2 стеклянные бусинки для равномерного кипения.

4. Пробирку нагревают 20—30 минут на песчаной бане при 180°С, пока смесь не станет бесцветной. Рекомендуется наблюдать за процессом, пока не пройдет образование пены — 5 минут. После охлаждения объем опытных проб доводят дистиллированной водой до 7 мл.

5. Для приготовления контрольной пробы берут 0,8 мл 57% раствора хлорной кислоты и доводят водой до 7 мл.

6. Готовят три стандарта (для достоверности), содержащие по 2 мл рабочего стандартного раствора однозамещенного фосфорнокислого калия и по 0,8 мл 57% раствора хлорной кислоты. Объем каждой стандартной пробы дистиллированной водой доводят до 7 мл.

7. Для определения фосфора в каждую пробирку (опытные, контрольные и стандартные) прибавляют по 1 мл 4% раствора молибденовокислого аммония, перемешивают и добавляют по 1 мл раствора амино-нафтолсульфоновой кислоты, доводя дистиллированной водой объем до 10 мл. Содержимое пробирок вновь перемешивают.

8. Через 20 минут после прибавления аминонафтолсульфоновой кислоты интенсивность окраски измеряют на ФЭКе против контроля при длине волны 630—690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Липоидный фосфор в 100 мл сыворотки в мг%; рассчитывают по формуле:

X = Еоп ∙ 0,02 ∙ 100/Ест ∙ 0,2 = Еоп ∙ 10/Ест

где X – липоидный фосфор в мг%;

Еоп – оптическая плотность опытной пробы;

Ест – оптическая плотность стандартной пробы;

0,02 – содержание фосфора в 2 мл стандарта (мг);

0,2 – количество сыворотки в опыте (мл).

Концентрацию общих фосфолипидов вычисляют умножением полученной концентрации липоидного фосфора на 25, так как липоидный фосфор составляет 4% (1/25 часть) молекулы фосфолипидов.

Норма концентрации липоидного фосфора у взрослых – от 6,1 до 14,5 мг% или 1,97—4,68 ммоль/л (коэффициент пересчета 0,323).

Рекомендации к составлению протокола

Пользуясь приведенными формулами, вычислить концентрацию липоидного фосфора и общих фосфолипидов в сыворотке крови.

В выводах сопоставить полученный результат с нормальными показателями.

11.2.2. Обнаружение фосфатидилхолина в желтке куриного яйца

Лецитины, относящиеся к группе фосфолипидов, не растворяются в воде и ацетоне, но хорошо растворяются в спирте, эфире, хлороформе.

Реактивы и материалы: спиртовой раствор лецитина (в стакан помещают половину куриного желтка и, помешивая, прибавляют 40 мл горячего спирта, раствор охлаждают и фильтруют в сухую пробирку); ацетон; дистиллированная вода.

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы.