Рекомендации к составлению протокола

Полученные данные практической работы занести в таблицу.

№ п/п	Разведение слюны	Количество крахмала, мл	Температура	Время течения реакции, мин	окраска с йодом

В выводах дать расчет активности амилазы в исследуемой слюне.

6.2. Определение активности каталазы крови по Баху и Зубковой

Каталаза относится к классу оксидоредуктаз. Высокая концентрация ее найдена в печени и эритроцитах крови. Каталаза катализирует расщепление перекиси водорода, образующейся при тканевом дыхании, и тем самым препятствует накоплению ее в токсических для организма количествах. Перекись водорода разлагается каталазой на воду и молекулярный кислород.

Принцип определения активности каталазы основан на измере­нии количества перекиси водорода, которое может быть разрушено ферментом в определенных условиях за заданное время. Доля раз­ложившейся перекиси водорода определяется по разности между количеством ее, взятым для опыта (контрольная проба) и остав­шимся после действия каталазы (опытная проба) путем титрования перманганатом в кислой среде.

2КМnО₄ + 5Н₂О₂ + ЗН₂SО₄ → 2Мn5О₄ + К₂SO₄ + 8Н₂О + 5О₂

Активность фермента выражают каталазным числом и показате­лем каталазы. Каталазным числом называют количество мг Н₂О₂, которое разлагается 1 микролитром (1 мкл равен 0,001 мл или мм³) исследуемой крови в условиях опыта.

Показателем каталазы называют отношение каталазного числа к количеству миллионов красных кровяных телец в одном мкл ис­следуемой крови.

Каталаза содержится почти исключительно в эритроцитах (в строме), и активность ее увеличивается или уменьшается при соответствующих колебаниях их числа. Поэтому при определении активности каталазы рекомендуется сравнивать показатели каталазы, не каталазные числа.

Реактивы и материалы: перекись водорода, 1% раствор, свежеприготовленный, серная кислота, 10% раствор, марганцовокислый калий, 0,1 н. раствор, этиловый спирт, диэтиловый эфир.

Оборудование и посуда: мерная колба на 100 мл, микропипетки на 0,1 мл, конические колбочки, бюретки, пипетки на 1 мл и 2 мл, пипетки на 10 мл с делениями.

Порядок выполнения работы

1. В мерную колбу на 100 мл наливают около 10 мл дистиллированной воды.

2. Берут кровь из безымянного пальца левой руки. Для этого кончик пальца обмывают стерильной дистиллированной водой, вытирают ватой и делают прокол иглой для взятия крови, предварительно вымытой спиртом и осушенной эфиром .

3. Первую выступившую каплю крови стирают сухой ватой. К появившейся новой капле прикасаются кончиком микропипетки, которую держат в горизонтальном положении. Кровь набирают выше метки 0,1 мл, после чего избыток ее удаляют прикосновением кончика пипетки к кусочку сухой ваты.

4. Пипетку опускают до дна в приготовленную мерную колбочку с дистиллированной водой и осторожно выдувают 0,1 мл крови. Затем пипетку промывают несколько раз путем втягивания и выливания жидкости.

5. Доливают мерную колбу водой до метки. Содержимое перемешивают и замечают время, когда кровь была разведена. Получается основное разведение крови (1:1000), содержащее в 1 мл 1 мкл крови. Оно используется для определения каталазного числа.

6.В две конические колбочки (опытную и контрольную) наливают по 7—8 мл дистиллированной воды и добавляют по 1 мл основного разведения крови.

7.Содержимое контрольной колбочки кипятят в течение 2 минут для разрушения каталазы, а опытную оставляют без изменения.

8.Обе колбочки оставляют стоять при комнатной температуре 30 минут считая с момента разведения крови.

9. В обе колбочки вносят по 2 мл 1% раствора перекиси водорода и вновь оставляют на 30 минут. Наблюдают за выделением пузырьков кислорода в опытной пробе.

10. В каждую колбочку наливают по 1 мл 10% раствора серной кислоты для прекращения действия фермента (в основной пробе) и создания кислой среды, необходимой для последующего титрования. Содержимое колбочек титруют 0,1 н. раствором марганцовокислого калия до розовой окраски.

11. На титрование контрольной пробы раствора марганцовокислого калия пойдет больше, так как каталаза там была инактивирована кипячением и перекись водорода не разлагала. В основной пробе часть перекиси водорода разрушается каталазой. Поэтому на титрование основной пробы раствора марганцовокислого калия затратится меньше. Находят разность между количеством 0,1 н. раствора КМnО₄, пошедшим на титрование контрольной и опытной проб.

12. Рассчитывают каталазное число. Исходят из того, что молекулярный вес Н₂О₂ равен 34, грамм-эквивалент равен 17 г, 1 мл 0,1 н. раствора содержит 0,0017 г или 1,7 мг Н₂О₂. Так как 1 мл 0,1 н. раствора КМnО₄ эквивалентен 1 мл 0,1 н. раствора Н₂О₂, то, умножив 1,7 на разность между количествами миллилитров 0,1 н. раствора марганцовокислого калия, пошедшими на титрование в конт­рольной и опытной пробах, получают количество мг перекиси водорода, которое разлагается 1 мкл исследуемой крови, взятой для анализа, т. е. непосредственно получается каталазное число. В нор­ме оно варьирует от 12 до 22.

Пример расчета. На титрование контрольной пробы ушло 12,3 мл 0,1 н. раствора марганцовокислого калия, а на титрование опытной пробы – 2,3 мл. Таким образом, каталазой было разложено: 12,3-2,3=10 мл, что соответствует 17 мг перекиси водорода (1,7 мг/мл∙10 мл = 17 мг).

Если определялось также число эритроцитов, то из полученного каталазного числа вычисляют показатель каталазы. У здоровых людей показатель каталазы может быть в пределах от 2,96 до 4,97.