5.7.2. Исследование действия липазы на липиды растительного происхождения

Реактивы и материалы: подсолнечное масло, дистиллированаявода, гидрокарбонат натрия 1%, спиртовыйо 1%раствор фенолфталеина, препарат липазы.

Оборудование и посуда: пробирки, пипетки, термостат.

Порядок выполнения работы

В две пробирки вносят по 1 мл подсолнечного масла и добавляют по 4 мл воды и 5 мл 1% гидрокарбоната натрия. Пробирки энергично встряхивают и добав­ляют 5 капель 1% спиртового раствора фенолфталеина. Затем в первую пробирку вносят 1 мл препарата липазы и перемешивают. Вторую пробирку оставляют без изменений. Обе пробирки ставят в термостат при 37 °С на 5-10 мин.

В пробирке с липазой раствор постепенно становится бесцветным, а в пробирке без липазы окраска не исчезает.

Объясните результат.

Работа № 6. Определение ферментативной активности

О количестве фермента чаще всего судят по его активности. Для выявления активности обычно определяют количество субстрата, изменяющегося под влиянием фермента в времени. Единица активности фермента, соответствующая превращению 1 моля субстрата за 1 секунду название «катал». Специфическая активность выражается отношением каталов на кг белка — кат/кг белка. Молекулярная активность выражается отношением каталов на моли ферментов — каталы/моли фермента. Концентрацию ферментативной активности следует выражать в каталах на литр — каталы/литр или микрокаталы/литр. Если субстрат служит белок, полисахарид или иная молекула, в которой фермент атакует более одной связи, то вместо микромоля субстрата следует учитывать микроэквивалент (мкэкв) затронутых реакцией групп. За превращением субстрата под влиянием фермента можно следить, пользуясь различными приемами (по убыли субстрата, по появлению в растворе тех или иных продуктов реакции, по изменению некоторых физических показателей и т. д.). При определении активности фермента следует строго соблюдать установленные методики условия опыта (температуру, кислотность, концентрацию субстрата).

6.1. Определение активности -амилазы по Вольгемуту

Количественное определение активности -амилазы по этому методу основано на установлении предельного разведения раствора -амилазы, при котором еще происходит в определенных условиях расщепление заданного количества крахмала до эритродекстрина.

Реактивы и материалы: слюна в разведении 1:10, крахмал, 0,1% раствор, свежеприготовленный, раствор йода в йодистом калии

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, пипетки на 1 мл, бюретки, карандаш для стекла, термостат или водяная баня.

Порядок выполнения работы

1.Собирают в пробирку слюну, переносят 1 мл ее в другую пробирку, куда добавляют из бюретки 9 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Получается раствор слюны 1:10.

2.В 10 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл воды.

3. В первую пробирку вносят 1 мл разбавленной в 10 раз слюны и перемешивают путем трехкратного втягивания и выпускания жидкости из пипетки. Затем 1 мл жидкости из первой пробирки переносят во вторую пробирку, перемешивая содержимое таким же образом, как это делалось ранее. 1 мл жидкости из второй пробирки переносят в третью, из третьей — в четвертую и т. д. Из десятой пробирки после перемешивания 1 мл жидкости удаляют. Таким образом, в первой пробирке слюна оказывается разбавленной в 20 раз, во второй — в 40, в третьей — в 80 раз и т. д.

4.Во все пробирки добавляют (начиная с десятой, где концентрация фермента наименьшая) по 2 мл 0,1% раствора крахмала. Содержимое всех пробирок перемешивают встряхиванием и помещают в термостат при 37 ºС на 30 минут.

5. Через 30 минут пробирки охлаждают под краном и добавляют в каждую по 1—2 капли раствора йода в йодистом калии. Отмечают пробирку с наибольшим разведением слюны, при котором произошло расщепление крахмала до эритродекстрина, дающего с йодом красно-бурое окрашивание. Активность -амилазы выражают количеством миллилитров 0,1% раствора крахмала, которое может расщепить 1 мл неразведенной слюны при 37 °С в течение 30 минут до стадии эритродекстрина.

Например, если с красно-бурой окраской жидкость была отмечена в четвертой пробирке, где слюна разбавлена в 160 раз и куда было прибавлено 2 мл 0,1% раствора крахмала, то 1 мл неразбавленной слюны расщепил бы в 160 раз больше 0,1% раствора крахмала: 1/160 мл слюны расщепляет 2 мл — 0,1% раствора крахмала, 1мл слюны расщепляет х мл 0,1% раствора крахмала, т. е. х = 2∙1:1/160 = 320 мл 0,1% раствора крахмала. Следовательно, 1 мл неразбавленной слюны расщепляет за 30 минут при 37 °С 320 мл 0,1% раствора крахмала. Условно это принимают за 320 единиц -амилазы по Вольгемуту. Результат принято изображать следующим образом: А 37º/30' = 320 ед.

Методом Вольгемута можно пользоваться для определения -амилазы в панкреатическом соке, крови, моче и других жидкостях организма.