Рекомендации к составлению протокола

Сделанные наблюдения записать в виде таблицы.

Исследуемый агент	Фермент	Субстрат	Время образования эритродекстрина

Время, затраченное на гидролиз крахмала до стадии эритродекстрина в первых двух пробирках, сопоставить со временем гидролиза крахмала в третьей пробирке (контрольной). На основании этого сопоставления сделать вывод об активирующем или ингибирующем действии взятых для исследования веществ.

5.6. Исследование ферментативной активности гидролаз

5.6.1. Выделение уреазы из соевой муки

Уреаза отличается высокой специфичностью действия, субстратом для нее является мочевина (диамид угольной кислоты). Уреаза содержится, например, в соевой муке.

Реактивы и материалы: соевая мука, смеси из 48 мл воды и 2 мл 0,1 н НС1 и нескольких капель толуола.

Оборудование и посуда: весы, фарфоровая ступка с пестиком, шейкер, центрифугира.

Порядок выполнения работы

3-5 г соевой муки тщательно растирают в фарфоровой ступке в смеси из 48 мл воды и 2 мл 0,1 н НС1 и нескольких капель толуола. Смесь взбалтывают 1 час, а затем центрифугируют 15 мин при 5 тыс. об/мин. Полученный прозрачный раствор используют в качестве препарата уреазы.

5.6.2. Установление специфичности действия уреазы

Метод основан на том, что уреаза катализирует расщепление мочевины на углекислый газ и аммиак. Появление аммиака обнаруживают при помощи индикатора (фенолфталеина).

Реактивы и материалы: 1% раствор мочевины, 1% раствор амида никотиновой кислоты, спиртовый раствор фенолфталеина, раствор уреазы, 5% раствор мочевины, 5% раствора ацетамида, соевоя мука, лакмусовая бумага.

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы, пипетки, термостат, весы.

Порядок выполнения работы

В одну пробирку наливают 2 мл 1% раствора мочевины, в другую - 2 мл 1% раствора амида никотиновой кислоты. В обе пробирки добавляют по 2-3 капли спиртового раствора фенолфталеина и 1 мл приготовленного ранее раствора уреазы. Пробирки помещают в термостат при 37 °С на 20 мин. Содержимое пробирок, в случае происшедшей реакции гидролиза, становится малиново-красным вследствие смещения реакции среды в щелочную область.

Параллельно с этим опытом делают другой: в одну пробирку отмери­вают 1 мл 5% раствора мочевины и в другую 1 мл 5% раствора ацетамида Затем в обе пробирки добавляют по 1 г соевой муки. Содержимое пробирок перемешивают и ставят при 37 °С на 5 мин. Наблюдают в пробирках различие в окраске. Проведите пробу на рН с лакмусовой бумагой. В пробирке с мочевиной выделяется аммиак и лакмусовая бумага синеет. В пробе с ацетамидом изменений не происходит.

5.6.3. Установление термолабильности уреазы

Реактивы и материалы: вытяжка уреазы, раствор мочевины, фенолфталеин, 10% раствора гидроксида натрия, лакмусовая бумага.

Оборудование и посуда: пробирки, водяная баня, термостат.

Порядок выполнения работы

Для определения берут две пробирки, в обе наливают по 1 мл вытяжки уреазы. Первую пробирку помещают на кипящую баню на 10 мин и охлаждают. Затем в обе пробирки добавляют по 1 мл раствора мочевины и по 1-3 капли фенолфталеина. Оставляют пробирки при комнатной темпера­туре на 5-10 мин. Записывают результат и делают вывод. Образование аммиака можно обнаружить и другим путем. С этой це­лью повторяют опыт и после термостатирования при 37 °С в реакционную смесь осторожно добавляют равный объем 10% раствора гидроксида на­трия. Выделение аммиака обнаруживают по запаху или по посинению лакмусовой бумажки у отверстия пробирки.