4.3.1. Гидролиз казеина и открытие в гидролизате белкового компонента и фосфорной кислоты
Для анализа в качестве фосфопротеина можно использовать казеин молока. При щелочном гидролизе казеин распадается на белок и фосфорную кислоту. Белок открывают биуретовой реакцией, а фосфорную кислоту молибденовой пробой. Ион РО" дает с молибдатом аммония в кислой среде фосфомолибдат аммония, который в результате восстановления гидрохиноном и сульфитом натрия переходит в молибденовую синь. Синий цвет пропорционален количеству молибдена в фосфомолибдате и, следовательно, количеству фосфора.
Реактивы и материалы: сухой казеин (порошок), гидроксид натрия 10% раствор, сульфат меди, 1% раствор, азотная кислота, 25% или концентрированная, аммоний молибденовокислый, раствор в азотной кислоте, гидрохинон, 2% раствор, раствор карбонат сульфита.
Оборудование и посуда: весы с разновесом, водяная баня, пипетки на 5 мл, стеклянные воронки с бумажным фильтром, штатив с пробирками, капельницы.
Порядок выполнения работы
К 100 мг сухого измельченного казеина прибавляют 5 мл 10% натра и помещают в кипящую водяную баню на 30 минут, помешивая время от времени содержимое пробирки.
После охлаждения к 10 каплям гидролизата прибавляют 5 капель 10% раствора гидроксида натрия и по каплям 1% раствор сернокислой меди до появления красно-фиолетового или сине-фиолетового окрашивания. Положительная биуретовая реакция доказывает белковую природу казеина.
Для открытия фосфорной кислоты к 20 каплям гидролизата прибавляют 10 капель 25% азотной кислоты (до кислой реакции) и 10 капель раствора молибденовокислого аммония в азотной кислоте. Оставляют стоять на 5 минут.
Образующийся осадок белка и высокомолекулярных продуктов неполного гидролиза белков отфильтровывают с помощью бумажного фильтра.
К фильтрату, содержащему фосфорномолибденовокислый аммоний прибавляют 10 капель 2% раствора гидрохинона и оставляют стоять на 5 минут.
6. К содержимому пробирки добавляют 20 капель раствора карбонат сульфита медленно, по каплям, во избежание сильного образования пены. В присутствии фосфорной кислоты постепенно развивается синее окрашивание раствора.
4.4. Гликопротеины
Гликопротеины – это белки, несущие ковалентносвязанные углеводы и их производные, а также нередко остатки серной и уксусной кислот. У некоторых гликопротеинов углеводная часть представлена мукополисахаридами. Они получили название мукопротеинов. При гидролизе белковая часть муцинов распадается на аминокислоты, а простетическая группа – на гексозы, гексозамины, нейраминовые кислоты и другие компоненты.
4.4.1. Выделение муцина и реакции на его белковую часть и углеводную группировку
Реактивы и материалы: уксусная кислота, 1% раствор, гидроксид натрия, 10% раствор, сернокислая медь, 1% раствор, -нафтол, 1% спиртовой раствор, серная кислота, концентрированная.
Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, стеклянные палочки.
Порядок выполнения работы
1. Для выделения муцина в пробирку собирают 5—10 мл слюны и добавляют такой же объем 1% раствора уксусной кислоты при помешивании стеклянной палочкой. Муцин выпадает в осадок в виде слизистого комочка.
2. Жидкость из пробирки осторожно сливают, задерживая муцин стеклянной палочкой.
3. Осадок муцина промывают водой, разделяют на две части, с которыми проделывают реакции на белок и углеводы.
4. Для открытия белка в пробирку помещают одну часть осадка муцина, добавляют при помешивании 10% раствор гидроксида натрия до растворения сгустка и проводят биуретовую реакцию. Положительный результат реакции доказывает белковую природу муцина.
5. Углеводы муцина обнаруживают нафтоловой пробой (реакция Подобедова-Молиша). Реакция обусловлена взаимодействием оксиметил-фурфурола, образующегося из гексоз под влиянием серной кислоты с -нафтолом. При этом образуется окрашенный продукт конденсации.
Ко второй половине осадка муцина добавляют 10—20 капель 1% спиртового раствора -нафтола, перемешивают и по стенке осторожно спускают равный объем концентрированной серной кислоты. На границе раздела жидкостей постепенно появляется фиолетово-красное кольцо, свидетельствующее о наличии углеводного компонента в составе муцина. Для развития окраски содержимое пробирки оставляют стоять на 1 час. Окрашенное кольцо хорошо заметно на белом фоне. Эта реакция дает положительный результат с любым углеводом - - как с простым, так и со сложным, а также со всеми веществами, в состав которых входят углеводы.