Рекомендации к составлению протокола

В лабораторном журнале описать принцип распределительной хроматографии на бумаге. Зарисовать хроматографическую систе­му. Хроматограмму подклеить в журнал и обозначить отдельные аминокислоты. Сравнить полученные коэффициенты распределения со стандартом.

Работа № 4. Сложные белки

Сложные белки состоят из белка и небелковой части, называемой простетической группой. В соответствии с этим сложные белки при гидролизе, наряду с аминокислотами, дают соединения другого характера, например нуклеиновые кислоты, углеводы, фосфорную кислоту и пр. В зависимости от природы простетических групп протеины подразделяются на нуклеопротеины, хромопротеины, фосфопротеины, гликопротеины, липопротеины, металлопротеины.

4.1. Нуклеопротеины

Нуклеопротеины – соединения нуклеиновых кислот и простых белков, связь между белком и нуклеиновой кислотой имеет большей частью электростатическую природу, т.е. кислотные группы нуклеиновых кислот взаимодействуют с аминогруппами белков.

Нуклеопротеины содержатся во всех клетках животных и растительных организмов, в вирусах. Особенно много их в тканях, богатых ядрами (зобной железе, селезенке, дрожжах и др.) Они нерастворимы в воде, растворяются в щелочах, при слабом подкислении снова осаждаются. В минеральных кислотах, даже очень разбавленных, растворяются легко.

Нуклеиновые кислоты выполняют в организме ряд важнейших функций: они обеспечивают хранение и передачу генетической информации, участвуют в механизмах, при помощи которых эта информация реализуется в процессе синтеза всех клеточных белков. Отдельные нуклеотиды являются небелковой частью ряда окислительно-восстановительных ферментов и носителями макроэргических связей, используемых для энергетического обеспечения многих обменных реакций в организме.

4.1.1. Кислотный гидролиз нуклеопротеинов дрожжей и определение их состава

Дрожжи являются материалом, богатым рибонуклеопротеинами. Для доказательства присутствия в молекуле рибонуклеопротеина белковой части, пуриновых радикалов, остатка фосфорной кислоты и углеводной группы (пиримидиновые основания отщепляются с трудом) дрожжи подвергают гидролизу кипячением с серной кислотой. В гидролизате открывают продукты гидролиза рибонуклеопротеинов качественными реакциями.

Реактивы и материалы: дрожжи пекарские, прессованные или сухие, серная кислота, 5% раствор, гидроксид натрия, 10% раствор, сернокислая медь, 1% раствор, аммиак, концентрированный раствор, аммиачный раствор азотнокислого серебра, орциновый реактив, аммоний молибденовокислый, раствор в азотной кислоте, флороглюцин, 0,2% раствор в 30% соляной кислоте, сернокислый магний, 5% раствор, хлористый аммоний, 10% раствор, лакмусовая бумага.

Оборудование и посуда: круглодонная колба с пробкой, снабженной длинной стеклянной трубкой, служащей обратным холодильником, мерный цилиндр на 50 или 100 мл, воронка с фильтром, штатив с пробирками, капельницы, весы аптечные.

Порядок выполнения работы

1.В круглодонную колбу на 100 мл помещают 5 г свежих дрожжей (или 1 г сухих) и добавляют 40 мл 5% раствора серной кислоты.

2. Колбу закрывают пробкой, снабженной обратным холодильником, укрепляют ее в штативе и осторожно кипятят содержимое под тягой на асбестовой сетке в течение 1—1,5 часов.

3.Через 1—1,5 часа от начала кипения гидролизат в колбе охлаждают, переливают в мерный цилиндр и путем ополаскивания колбы дистиллированной водой доводят объем жидкости до первоначального.

4. Полученный раствор отфильтровывают и проделывают с ним реакции на присутствие белка и полипептидов, пуриновых оснований, углевода, фосфорной кислоты.

5.Белок и полипептиды открывают биуретовой пробой. К 5 каплям гидролизата добавляют 10% раствор гидроксида натрия до щелочной реакции (примерно 10 капель) и по каплям (1—2 капли) медного купороса до появления розово-фиолетовой или розовой окраски.

6. На пуриновые основания производят серебряную пробу. К 10 каплям гидролизата добавляют раствор аммиака до щелочной реакции на лакмус (примерно 2—3 капли) и добавляют 5 капель аммиачного раствора азотнокислого серебра. В присутствии пуриновых оснований образуется бурый осадок их серебряных соединений. Если осадок тотчас не образовался, жидкости дают некоторое время спокойно постоять.

7.Углевод (пентозу) обнаруживают пробой Троммера, реакцией с орцином и реакцией с флороглюцином.

А. В основе пробы Троммера лежит окислительно-восстановительный процесс: в щелочной среде при нагревании альдегидная группа сахара окисляется, а гидрат окиси меди (осадок голубого или синего цвета) восстанавливается в гидрат закиси меди (осадок желтого цвета) или в закись меди (кирпично-красный осадок). Сахара, не имеющие свободной альдегидной группы, пробу Троммера не дают.

Окислительно-восстановительную реакцию можно представить в виде следующей схемы:

В пробирку наливают 10 капель гидролизата и нейтрализуют по лакмусу 10% раствором гидроксида натрия. К нейтрализованной жидкости добавляют равный объем 10% раствора гидроксида натрия и по каплям 1% раствор сернокислой меди до образования не исчезающей при взбалтывании голубой мути гидрата окиси меди. Осторожно нагревают до кипения верхнюю часть содержимого пробирки. Появляется желтый осадок гидрата закиси или кирпично-красный осадок закиси меди. Образование осадка указывает на наличие в гидролизате углевода, образовавшегося при гидролизе. Раствор медного купороса следует прибавлять очень осторожно, так как избыток гидроокиси меди переходит при нагревании, теряя воду, в черную окись меди, что затемняет основную реакцию. В случае определения углевода в нейтральной жидкости предварительная нейтрализация ее раствором гидроксида натрия не требуется.

Б. Реакция с орцином. К 10 каплям гидролизата добавляют равный объем орцинового реактива и нагревают до кипения. Наличие пентозы в гидролизате обусловливает при этом развитие зеленого окрашивания жидкости. Реакция зависит от того, что пентозы при нагревании с соляной кислотой (входящей в состав орцинового реактива) образуют фурфурол, который при взаимодействии с орцином дает окрашенные соединения.

Орцин Фурфурол Флороглюцин

В. Реакция с флороглюцином. К 10 каплям гидролизата добавляют равный объем раствора флороглюцина и нагревают до кипения. Появляется розовое окрашивание, переходящее затем в красное. Реакция обусловлена взаимодействием флороглюцина с фурфуролом, образующимся из пентозы при нагревании с соляной кислотой, в которой растворен флороглюцин.

8. Фосфорную кислоту открывают молибденовой пробой и пробой с магнезиальной смесью.

А. Молибденовая проба. К 10 каплям гидролизата прибавляют равный объем раствора молибденовокислого аммония в азотной кислоте и кипятят несколько минут. Содержимое пробирки охлаждают под струей холодной воды и наблюдают выпадение лимонно-желтого кристаллического осадка комплексного соединения фосфорномолибденовокислого аммония, свидетельствующего о наличии в гидролизате фосфорной кислоты.

H₃PO₄ + 12(NH₄)₂MoO₄ + 21HNO₃ → (NH₄)₃(PO₄ · 12MoO₃) + 21NH₄NO₃ + 12H₂O

Б. Проба с магнезиальной смесью. В пробирку наливают 10 капель гидролизата и подщелачивают его концентрированным раствором аммиака. Добавляют равный объем магнезиальной смеси. Образуется белый кристаллический осадок двойной аммонийно-магниевой соли фосфорной кислоты (фосфорнокислый магний-аммоний) Mg(NH₄)PO₄. Раствор магнезиальной смеси готовят в отдельной пробирке следующим образом: к нескольким каплям 5% раствора сернокислого (или хлористого) магния добавляют по каплям концентрированный раствор аммиака до прекращения образования осадка и затем по каплям 10% раствор хлористого аммония до растворения осадка Mg(OH)₂.