Порядок выполнения работы

1. В пробирку наливают приблизительно 1—1,5 мл (20—30 ка­пель) сыворотки крови и добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония. Получается полунасыщенный ра­створ сернокислого аммония. Выпадает осадок глобулинов.

2. Через 10 минут выпавший осадок глобулинов отфильтровыва­ют. В фильтрате остается другая фракция белков—альбумины.

3. К фильтрату, содержащему альбумины, добавляют порошок сернокислого аммония до насыщения (до того момента, когда часть кристаллов сернокислого аммония остается нерастворимой, несмот­ря на взбалтывание). Выпадает осадок альбуминов.

4. Осадок альбуминов отфильтровывают и с фильтратом проде­лывают биуретовую реакцию. Отрицательная ре­акция указывает на отсутствие белка.

5. В пробирку наливают приблизительно 1—1,5 мл (20—30 ка­пель) сыворотки крови и добавляют порошок хлористого натрия до полного насыщения. Через несколько минут выпадает осадок гло­булинов.

6. Выпавший осадок глобулинов отфильтровывают.

7. В фильтрате от глобулинов остаются альбумины. Для их осаж­дения к фильтрату добавляют 1—2 капли 1% раствора уксусной кис­лоты и кипятят. Выпадает осадок альбуминов.

8. Осадок альбуминов отфильтровывают и производят с фильт­ратом биуретовую реакцию. В отсутствии белка в фильтрате от аль­буминов убеждаются по отрицательным результатам биуретовой пробы.

Рекомендации к составлению протокола

Полученные данные при высаливании белков записать в таблицу. В графе «Осаждаемая фракция» положительный результат от­метить знаком +. В выводах указать, какая из белковых фракций легче осаждается и причины этого.

Электролит	Степень насыщения	Реакция среды	Осаждаемая фракция
			альбумины	глобулины

Работа №3. Макромолекулярная природа белка

Обнаружение многих аминокислот, выявляемых, например, цветными реакциями в составе белка, позволяет предполагать о большом размере протеинов. С помощью физических методов установлено, что молекулярные веса разных белков могут колебаться от 6000 дальтон до 1 000 000 дальтон и выше.

31. Сопоставление молекулярного веса гемоглобина и рибофлавина

Хорошую возможность для разделения веществ с различными размерами молекул и даже для определения молекулярных весов некоторых белков предоставляет метод гель-фильтрации. При гель-фильтрации окрашенных смесей их разделение можно устанавливать визуально. Для удобства лучше взять слож­ный белок гемоглобин и рибофлавин.

Реактивы и материалы: гемоглобин, 5% раствор в 0,9% растворе хлористого натрия или гемолизированная профильтрованная кровь, рибофлавин, насыщенный раствор, хлористый натрий, 0,9% раствор.

Оборудование и посуда: стеклянная хроматографическая колонка 1,6x20 см, запол­ненная гелем «Сефадекс Г-25» в 0,9% растворе хлористого натрия и имеющая кран на нижнем конце, склянка с тубусом, содержащая элюирующий раствор 0,9% хлористого натрия, которую через резиновую трубку можно присо­единить к верхнему концу колонки, пипетки на 1—2 мл, мерный цилиндр на 50 мл.