1.8. Реакция с формальдегидом

При взаимодействии a-аминокислот с формальдегидом образуются относительно устойчивые карбиноламины – N-метилольные производные, содержащие свободную карбоксильную группу, которую затем титруют щелочью:

Эта реакция лежит в основе количественного определения a-аминокислот методом формального титрования (метод Сёренсена).

Реактивы и материалы: 1%-ный раствор глицина, индикатор метиловый красный, 40%-ный раствор формальдегида.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, пипетки.

Порядок выполнения работы

В пробирку наливают 5 капель 1%-го раствора глицина и прибавляют 1 каплю индикатора метилового красного. Раствор окрашивается в желтый цвет (нейтральная среда). К полученной смеси добавляют равный объем 40%-го раствора формальдегида (формалин). Появляется красное окрашивание (кислая среда):

Работа №2. Реакции осаждения белков

Физико-химические свойства белков в значительной степени определяются их высоким молекулярным весом (белки - гидрофиль­ные коллоиды), амфотерностью (белки - амфотерные электроли­ты) и лабильностью вторичной и третичной структур белка.

Белки под влиянием нагревания или воздействия органических растворителей, концентрированных минеральных кислот, органи­ческих кислот, солей тяжелых металлов, алкалоидных реактивов и других факторов претерпевают глубокие изменения, называемые денатурацией. Под денатурацией понимают негидролитическое раз­рушение белковой молекулы с деградацией ее вторичной и третич­ной структур.

Существуют различные способы изменения окружающей среды, влияющие на баланс слабых сил в водных растворах белков. Неко­торые из них используются для осаждения белков.

1. Повышение температуры оказывает дезорганизующее влия­ние на растворитель и на макромолекулу путем увеличения энер­гии ее пептидных цепей. В результате возникают развернутые фор­мы ранее глобулярных белков.

2. Изменение концентрации водородных ионов приводит к свя­зыванию протонов ионизирующимися группами и модификации заряда белка. В результате видоизменяются не только ионные свя­зи, стабилизирующие нативную структуру протеинов, но и меж­молекулярные взаимодействия.

3. Добавление значительных количеств неводных растворителей (спирты, органические кислоты) и просто углеводородов может влиять на конформацию белков либо при непосредственном свя­зывании, либо косвенно, уменьшая диэлектрическую константу среды и, следовательно, увеличивая внутри- и межмолекулярное электростатическое взаимодействие. Кроме того, при прибавлении менее полярных, чем вода, и просто гидрофобных веществ проис­ходит разрушение гидрофобного ядра, т. к. термодинамически бо­лее выгодным становится развернутое (денатурированное) состояние ввиду изменения структуры растворителя.

4. Добавление нейтральных солей изменяет электростатическое взаимодействие путем экранирования зарядов в белках. При посте­пенном увеличении концентрации электролита сначала раствори­мость белка возрастает, а затем уменьшается. Важное значение в последнем процессе, кроме экранирования зарядов, имеет отнятие гидратной оболочки с поверхности протеинов.

5. Ионы тяжелых металлов, таких как серебро, медь, ртуть и свинец, соединяются с тиоловыми и карбоксильными группами и в высоких концентрациях служат осадителями белков.

В некоторых случаях при удалении денатурирующего агента может наблюдаться более или менее полное восстановление свойств белка. Осаждение белков высаливанием с помощью сернокислого аммония (в различных концентрациях) или других средних солей щелочных и щелочно-земельных металлов с последующим их уда­лением путем диализа практикуется для получения очищенных ферментных и гормональных препаратов из органов и тканей, а также лечебных сывороток и вакцин. С той же целью применяют осаждение белков непродолжительным действием спирта или ацетона при низкой температуре.