20. Простые и сложные методы окраски. Механизм окраски по Граму.

Способы окрашивания микробов делятся на простые и сложные, или дифференциальные.

При простой окраске употребляется только один краситель, чаще всего - фуксин Пфейффера (экспозиция 1-2 мин), или синька Леффлера (экспозиция 3-5 мин). Их относят к группе анилиновых красителей. Сложные, или дифференциальные способы окраски бактерий основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки, и применяются для детального изучения структуры клетки, также для дифференциации данного микроба от других. Способность микробов воспринимать красители называется тинкториальными свойствами.

Простые		Сложные (основные)
Метод	Цель	Метод	Цель
Окраска метиленовым синим	Изучение: формы бактерий их расположения в мазке	Окраска по Граму (основной метод окраски в бактериологии)	Определение типа строения клеточной стенки
		Окраска по Цилю-Нильсену	Выявление: - кислотоустойчивых бактерий (микобактерий) - спор
		Окраска по Нейссеру	Выявление включений волютина и идентификация по их наличию коринебактерий
Окраска водным фуксином		Окраска по Бурри-Гинсу	Выявление капсул
		Окраска по Морозову	Выявление: жгутиков трепонем вирусов натуральной и ветряной оспы
		Окраска по Здрадовскому	Выявление хламидий
		Окраска по Романовскому-Гимзе	Выявление: риккетсий спирохет простейших

Окраска по Граму (механизм)

Этап	Продолжительность	Результат
		Грамположительные	Грамотрицательные
Генциановый фиолетовый	1 – 2 минуты	Синие	Синие
Раствор Люголя	1 – 2 минуты	Синие	Синие
Этиловый спирт с последующим промыванием водой	½ минуты	Синие	Бесцветные
Водный фуксин	1 – 2 минуты	Синие	Красные

Грамхарактеристика основных форм бактерий

• Шарообразные формы бактерий - кокки грамположительны (Гр+), за исключением гонококка, менингококка и катарального микрококка.

• Цилиндрические формы: спорообразующие палочки - бациллы и клостридии – Гр+.

• Неспорообразующие (собственно бактерии) – грамотрицательны (Гр-), за исключением актиномицетной линии бактерий. В последнюю входят: коринебактерии, в т. ч. возбудитель дифтерии; микобактерии – возбудители туберкулёза, микобактериозов и актиномикоза.

• Актиномикотическая друза окрашивается по Граму смешанно: аморфный центр - Гр+, периферия - Гр-.

• Извитые формы: вибрионы, спириллы, спирохеты – Гр-.

• Риккетсии, хламидии - Гр-.

• Микроорганизмы с дефектами или не имеющие КС–Гр-.

21. Морфология и ультраструктура спирохет. Методы микроскопии.

Систематическое положение спирохет.

Царство. Prokaryotae

Отдел. Gracilicutes

Порядок. Spirochaetales

Семейство 1. Spirochaetaceae

Роды.1.Treponema

2.Borrelia

Семейство 2.Leptospiraceae

Род. 3.Leptospira

Род	Treponema	Leptospira	Borrelia
Особенности морфологии	8 – 12 завитков одинаковой амплитуды	Первичные завитки практически не видны, а вторичные крупные и образуют на концах «крючья», направлены в одну или в разные стороны	Амплитуда и количество завитков не постоянны (от 3 до 20)
Особенности ультраструктуры	В периплазматическом пространстве клеточной стенки вдоль всего тела бактерий проходит осевая нить (аксиальная нить или фибрилла), состоящая – аналогично жгутику – из сократительного белка флагеллина и служащая органом движения. Поэтому спирохеты двигаются благодаря сокращению всего тела
Окраска по Романовскому-Гимзе	Розовые	Красные	Синие
Преимущественно используемый для обнаружения вид микроскопии	Темнопольная микроскопия		Любой вид микроскопии

Методы выявления спирохет.

- Спирохеты плохо воспринимают красители. Обычно их окрашивают по методу Романовского-Гимзе или серебрением по Морозову, а также применяют негативное окрашивание по методу Бурри; в живом виде их исследуют с помощью фазово-котрастной и темнопольной микроскопии.

Метод Романовского-Гимзе. Краситель состоит из эозина, метиленового синего и азура растворенных в смеси метанола с глицерином. Базофильная зернистость окрашивается в синий цвет, эозинофильная - в красный, а нейтрофильная - в сиреневый цвет.

Техника окраски.

1. Приготовить микроскопический препарат и обработать его в жидком фиксаторе.

2. Поместить фиксированный препарат на два стеклянных валика в чашку Петри вниз ко дну и подливают разведенный в 10-20 раз свежеприготовленный краситель. Окрашивание длится от 30-60 минут до нескольких часов.

3. Мазки промывают водой и высушивают на воздухе.