Мембранотропные свойства ксенобиотиков

Первичной мишенью биологического действия ксенобиотикои на клеточном уровне является плазматическая мембрана. В основе взаимодействия ксенобиотиков с мембранами клеток и наступаю щих в результате этого функциональных сдвигов лежит модифика ция мембранных структур (или систем, непосредственно связанных с происходящими на мембранах процессами). Говоря о мембрано тропном действии ксенобиотика (или любого химического агента), имеют в виду прямую или косвенную (опосредованную) модифика цию мембранных структур

Существуют 4 типа мембранотропности ксенобиотиков:

1. Мембранная рецепция. В этом случае вещество не проникает во внутрь клетки, а избирательно накапливается в мембранах или специфически связывается. Происходит прямой мембранотропный эффект.

2. Вещество стимулирует или угнетает биосинтетические мембранные процессы (активность ферментов, скорость синтеза белков, липидов и т.д.). Первичность и опосредованность эффекта оценивается конкретно в каждом случае.

3. Изменение под влиянием ксенобиотиков барьерно - транспортных свойств мембраны. Мембранотропность такого рода может быть прямой и опосредованной

4. Мембранотропность ксенобиотиков может определяться функциональным взаимодействием с веществами, механизм действия которых на мембранном уровне хорошо известен. Экспериментально выявляется стимуляция или угнетение под влиянием ксенобиотиков ряда гормонов, природных соединений.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Лабораторная работа № 7

Действие ксенобиотиков на проницаемость мембран растительных клеток

Цель работы:

1. 1.Изучить строение, функции мембран, мембранотропность ксенобиотиков.

2. Исследовать проницаемость клеточных мембран столовой свеклы под действием различных ксенобиотиков.

3. Исследование проницаемости клеточных мембран клеток верхнего эпидермиса лука плазмолитическим методом под действием различных ксенобиотиков

Принцип метода

Одной из общих, неспецифичных и быстрых реакций клетки на воздействие внешних факторов или токсикантов является изменение проницаемости мембран. При повышении температуры, изменении кислотности среды или действии токсических веществ происходит нарушение проницаемости мембран, обусловленное либо денатурацией белков, либо изменением вязкости липидной составляющей, либо разрывом ультрамолекулярных связей в липидном слое. По этой причине проницаемость мембран используют как показатель устойчивости клетки к различным воздействиям, в том числе и к токсическим веществам.

Суть первой части настоящей работы заключается в определении изменения проницаемости мембран, основанном на выходе из клетки различных веществ под влиянием токсикантов. Объектом исследования является столовая свекла, в клеточном соке которой находится бетацианин, относящийся к классу гликозидов. Бетацианин придает свекле красно-фиолетовый цвет. При нарушении проницаемости мембран гликозид выходит из клеток. Определить появление бетацианина можно по изменению оптической плотности исследуемого раствора на фотоэлектрокалориметре, которая будет пропорциональна степени повреждения проницаемости мембран.

Целью второй части настоящей работы является в изучение воздействия различных ксенобиотиков на проницаемость клеточных мембран верхнего слоя эпидермиса лука репчатого. Результат воздействия чаще всего проявляется в уменьшении количество внутриклеточной воды, что приводит к деформации (плазмолизу) клетки эпидермиса лука. Изменение формы клетки лука можно наблюдай, с помощью микроскопа. Чем больше степень токсичности ксено биотика, тем большей деформации будут подвергаться клетки.

Средства измерения, приборы, вспомогательные устройства, реактивы, материалы. Весы аналитические, сушильный шкаф микроскоп, ФЭК, пробирки, штатив для пробирок, сверло пробко вое, лезвие безопасной бритвы, пипетка с делением вместимостью 1, 2, 5, 10 мл, мерный цилиндр 10мл, колбы мерные 50, 100, 200 мл, воронка Бюхнера, водяная баня, пинцет, 1М, 0,5М растворы сахарозы, 30% раствор уксусной кислоты, 50% раствор этилового спнр та,0,1М,1М растворы соляной кислоты, 0,1М, 1М растворы гидроксида калия, 1М раствор фенола, 1М раствор хлорида олова в 10% растворе соляной кислоты, красная свекла, лук репчатый.

Ход работы

Исследование проницаемость клеточных мембран столовой свеклы под воздействием различных ксенобиотиков фотометрическим методом

Подготовка исследуемого материала. Из очищенной свеклы вырезать с помощью пробкового сверла цилиндрический столбик с диаметром около 1 см. Извлечь его, затем разрезать на диски толщиной 2 мм с помощью лезвия безопасной бритвы. Для исследования отобрать 16 одинаковых по окраске дисков. Диски тщательно промывают под струей водопроводной воды на воронке Бюхнера.

Подготовка растворов. В соответствии с вариантом исследова­ния налить в пробирку по 7 мл исследуемых растворов (в пробирки 1, 2, 4 налить дистиллированную воду). Пробирки поставить в штатив в соответствующем порядке. Одну пробирку с водой и с раствором сахара поставить на водяную баню с температурой 35°С. Налить из пробирки 4 варианта около 1-1,5 мл воды в пустую пробирку и поставить ее в кипящую воду.

Промытые диски поместить по 2 штуки в исследуемые пробир­ки, кроме четвертой, а так же в пробирку с кипящей водой. Через 1 минуту содержимое этой пробирки перелить назад в четвертую пробирку

Проведение измерений Через каждые 15 минут на ФЭКе определить оптическую плотность растворов (светофильтр синий, длина волны 440 нм), предварительно перелив их в кюветы. После каждого измерения растворы залить обратно в пробирки. Колориметрирование производить относительно чистой воды, по ней прибор устанавливается на 0.

Результаты измерений оформить в виде табл. 7.1.

Таблица 7.1

Результаты измерения оптической плотности

№ п/п	Вариант исследования	Оптическая плотность раствора
		начальная	через 15 мин	через 30 мин	через 45 мин	через 60 мин	через 75 мин
t	Вода при комнатной температуре (контроль)
2	Вода при 35°С
3	0,5М раствор сахарозы
4	Кратковременное кипячение
5	30% раствор ук­сусной кислоты
6	50%раствор эти­лового спирта
7	0,1М раствор соляной кислоты
8	0,1М раствор гидроксида калия

Оформление результатов

1. Построить графики изменения оптической плотности растворов (зависимость изменения оптической плотности от времени)

2. Сравнить полученные результаты между собой, а так же с вариантом 1 (контроль) и с вариантом 4 (кипячение). Отметить характер воздействия на мембраны исследуемых клеток.

3. Отметить динамику изменения оптической плотности растворов.

4. Объясните механизм воздействия на мембрану изучаемых факторов и оценить результат воздействия для живой клетки.

5. Сделать соответствующие выводы. Результаты оформить в виде табл. 7.2

Таблица 7.2

Анализ результатов эксперимента

N п/п	Раствор	Анализ графиков (раствор+раств. 1+раств 4)	Характер воздействия, тип мембрано-тропности ксенобиотика	Уравнения возможных реакций	Выводы
1	0,5М раствор сахарозы
2	Вода при 35°С
3	30% раствор уксусной кислоты
4	50%раствор этилового спирта
5	0,1М раствор соляной ки­слоты
6	0,1М раствор гидроксида калия

Определение плазмолиза клеток верхнего эпидермиса лука под воздействием различных ксенобиотиков

Сделать 6 срезов эпидермиса лука. Один срез рассмотреть в микроскоп и зарисовать его изображение. В пронумерованные про­бирки налить по 1 мл 1М раствора сахарозы. Начиная со второй пробирки добавить несколько капель ксенобиотика. Растворы в пробирках перемешать взбалтыванием. В каждую пробирку погрузить полностью в раствор по одному срезу эпидермиса лука и оста­вить на 30 минут, после чего срезы рассмотреть под микроскопом и описать наблюдаемую картину плазмолиза. Результаты анализа и выводы оформить в виде табл. 7.3

Таблица 7.3.

Определение плазмолиза клеток верхнего эпидермиса лука под воздействием различных ксенобиотиков

	Раствор	Рисунок до введения ксенобиотика	Наличие плазмолиза	Рисунок после введения ксенобиотика	Степень влияния ксенобиотиков	Выводы
1	1М сахароза
2	1М соляная кислота
3	1М гидро-ксид калия
4	50% этиловый спирт
5	1М фенол
6	1М хлорид олова

Контрольные вопросы

1. Каково строение биомембраны?

2. Перечислите функции составных компонентов биомембраны.

3. Назовите функция биомембраны в клетке.

4. Какие существуют пути поступления питательных веществ в клетку?

5. Приведите мембранотропные свойства ксенобиотиков.

6. В чем заключается принцип колориметрического и плазмоли-тического методов определения изменения проницаемости клеточ­ных мембран под воздействием ксенобиотиков.

7. Каким образом физические и химические (токсиканты) факторы воздействуют на проницаемость биомембран?

Нитраты в продуктах питания

Актуальность К токсикантам неорганической природы относятся нитраты. Уровень содержания нитратов в некоторых поверхностных водах, колодцах, почвах, пищевых продуктах, поступающих из сельскохозяйственных угодий и животноводческих ферм, создает серьезную экологическую проблему. Будучи сами по себе токсичными, попав в организм эти вещества могут превращаться в еще более токсичные нитриты и диазосоединения .

Основными источниками нитратов в пище являются овощи, мясные продукты, фрукты, соки. Выполнение данной работы обобщит и расширит знания об источниках, токсическом воздействии, способах определения нитратов в пищевых продуктах

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Нитраты - это соли азотной кислоты. Они являются важнейшим звеном природного круговорота азота, одного из основных биогенных (необходимых для жизни) элементов.

Азот способствует ассимиляции и синтезу органических веществ, стимулирует нарастание вегетативной массы и развитие растений. Он имеет решающее значение при синтезе белков, аминокислот, хлорофиллов, многих витаминов и ряда других соединений. При его недостатке рост растений замедляется, снижаются темпы накопления органического вещества, ухудшается фотосинтетическая деятельность, тормозится образование ферментов, аминокислот и других жизненно важных соединений. Острая нехватка азота задерживает образование репродуктивных органов и может вызвать гибель посевов.

Установлено, что основную долю необходимого для жизнедеятельности азота растения получают именно в нитратной форме.

В растениях под действием ферментов и при участии микроэлементов нитраты превращаются в аминокислоты и белки (N03→N02→NH3→ аминокислоты→белки), специфические для п.ч нормальной жизнедеятельности. Роль белков в организме исключительно важна. Они выполняют структурные, энергетические, ферментативные и наследственные функции. Промежуточным этапом при синтезе белков является образование аминокислот. Следует отметить, что некоторые жизненно важные для человека аминокислоты могут быть синтезированы только в растениях.

Если содержание нитратов в почве превышает оптимальное, m они поступают в растение в чрезмерных количествах. В результат нитраты, которые не могут быть преобразованы в органические со единения, могут накапливаться в растительной продукции (листьях, клубнях, корнеплодах и т.д.). В дальнейшем, нитраты, содержащиеся в растениях в избыточных количествах, по трофическим путям попадают к человеку.

Источники поступления нитратов в растительную продук­цию. Основной путь попадания нитратов в человеческий организм через пищеварительный тракт. В свою очередь нитраты могут попадать в растительную продукцию из окружающей среды по цепи почва - удобрение - вода - растение. Источники поступления нитратов в окружающую среду подразделяются на природные и антропогенные.

Природные, Образование нитратов и нитритов в окружающей среде (почве, поверхностных и грунтовых водах) связано с круговоротом азота (приложение). В процессе биологического окисления из иона аммония образуются сначала нитриты а затем нитраты (нитрификация). Этот процесс осуществляется микроорганизмами. Растения усваивают только часть нитратов из почвы (25-85%). Остальное вымывается в реки и океаны или подвергается денитрификации, т.е. разрушению до нитритов и оксидов азота.

Антропогенные источники поступления нитратов более разнообразны и потенциально опасны. Из них основным являются минеральные азотные удобрения. Дополнительное внесение азотных удобрений это необходимое условие получения высоких урожаев с/х продукции. В РБ в начале 90-х годов усредненные нормы внесе­ния азотных удобрений составляли 90-100 кг действующего веще­ства на гектар. В то же время оптимальные дозы азота, которые могут быть свободно утилизированы почвенной экосистемой, не должны превышать 70-80 кг/га. Повышенные нормы минеральных азотных удобрений, а также их неравномерное внесение является одной из главных причин накопления нитратов в растениях, а также насыщения ими водоемов (приложение 2). Следует отметить, что в последние годы средние нормы внесения азотных удобрений сни­зились до 55-60 кг/га. Тем не менее, учитывая несовершенство средств механизации, а также неравномерность применения удобрений в зависимости от культуры, проблема остается открытой.

Органические удобрения. Органические удобрения, в том числе навоз, содержат большое количество азота, который легко превра­щается в нитраты. Согласно проведенным исследованиям, на регулярно удобряющимися навозом почвах, содержание нитратов в 10-метровой толще может быть в 3-4 раза выше, чем при использо­вании минеральных удобрений. В связи с этим разработаны нормы внесения органических удобрений оптимальные с точки зрения восстановления почвенного плодородия и воздействия на окружающую среду.

Однако такие факторы как интенсификация отрасли животноводства, строительство крупных комплексов обуславливают скопление органических отходов и превращаются в мощный источник локального загрязнения нитратами. Типовые животноводческие комплексы на 100 тысяч голов свиней по своему влиянию на окружающую среду эквивалентны городу с населением 350-400 тысяч человек, при этом объем жидких навозных стоков составляет около 1 млн кубометров в год. Как следствие, на землях расположенных вблизи свиноводческих комплексов трудно получить качественную (в соответствии с существующими нормами) растительную продук­цию. В настоящее время в РБ построено 6 таких комплексов.

Индустриальные и коммунально-бытовые отходы. Промышленные и бытовые стоки являются менее опасными источниками нитратов по сравнению с сельскохозяйственными. Тем не менее, количество азота в бытовых отходах составляет приблизительно 5 кг на человека в год, который представлен преимущественно в аммонийной форме. В ходе биологической очистки уровень N0₃ -в промстоках возрастает, а на отдельных предприятиях очистные схемы и вовсе не предусматривают удаление нитратов. Обогащенные нитратами воды попадают в канализационную сеть и водоемы либо вносятся с целью очистки и утилизации на поля или заболо ченные участки. В конечном итоге они становятся дополнительным источником нитратов не только в питьевой воде, но и с/х продукции.

Накопление нитратов в растительной продукции зависит от многих факторов. Например, от ботанического вида растений (в томатах их в 15-20 раз меньше, чем в зеленых овощах), или от сорта (ранние сорта картофеля и овощей содержат в 1,5-2 раза больше ннт ратов, чем поздние).

Распределение нитратов в различных органах растений также происходит неравномерно. Установлено, что верхние листья, например капусты, содержат, как правило, больше нитратов, чем внутренние. Огурцы, кабачки, арбузы, дыни, баклажаны и т.д. характеризуются повышенным содержанием нитратов в плодах, увеличением содержания нитратов от центра к периферии и достижения максиму ма возле кожи и самой кожуре.

В то же время у кабачков количеств < NO3 уменьшается от плодоножки к его верхушке. В клубнях карт феля уровень накопления нитратов в кожуре выше, чем в мякоти.

В целом у растений содержание нитратов может повышаться п 2-4 раза при избытке и недостаточной солнечной радиации. Меньше накапливается нитратов на легких почвах, чем на связных и наибо лее высокое содержание наблюдается на торфяных почвах.

Усиленное накопление нитратов происходит при всех отклоне­ниях от нормальных условий роста (переувлажнении, засухе, колебании температуры, недостатке или избытке питательных веществ, повреждения растений вредителями и болезнями).

Меньше содержание нитратов у более вызревших растений.

Процесс восстановления нитратов в нитриты значительно замедляется при хранении овощей в холодильнике, особенно в замороженном виде и ускоряется при приготовлении продуктов в алюминиевой посуде.

Измельчение и перетирание овощей создает идеальное условие для микроорганизмов, восстанавливающих нитраты в нитриты. Раз личные методы кулинарной обработки продуктов позволяют снизить содержание нитратов в них.

Действие нитратов на организм человека

Существует один основной путь воздействия нитратов на чело­веческий организм - через пищеварительный тракт. Основным ис­точником поступления нитратов в организм человека являются во­да, продукты растительного происхождения. С водой и овощами в организм человека поступает от 75 до 90% общего количества нитратов. Продукты животного происхождения: мясные, молочные, яйца и рыба содержат незначительное количество нитратов. Концентрация нитратов в консервированных и копченых мясных про­дуктах (в качестве стабилизатора цвета и консерванта) изменяется в широком интервале от 0 до 70 мг N0₂/кг. Концентрация нитратов в молочных продуктах обычно не превышает 5 мг/л, в свежей рыбе -0,7-3,3 мг/кг, во фруктах и фруктовых соках до 7 мг/кг. В дальнейшем примерно 50-80 % нитратов выводится из организма почками в течение 4-12 часов, частично они всасываются в кровеносную систему, и частично восстанавливаются обитающей в желудочно-кишечном тракте микрофлорой. При этом в зависимости от вида микроорганизмов, рН среды и имеющихся питательных веществ (микроэлементы, углеводы), могут образовываться следующие со­единения: нитриты (N0₂^-)₅ окислы азота (N_xO_y), гидроксиламин (NH₂OH), аммоний (NH₄⁺), которые всасываются тканями.

Отрицательное действие нитратов подразумевает суммарную ток­сичность нитритов и нитратов, выраженную в острой и хронической форме. Опасность негативных последствий поступления нитратов усугубляется возможностью синтеза канцерогенных нитрозосоединений.

Наибольшую опасность для человека представляют нитриты. Из желудочно-кишечного тракта они легко проникают в кровь и пройдя через мембрану эритроцитов вступают в реакцию с гемоглобином. Входящее в состав гемоглобина железо в результате окисляется, переходя из двухвалентной в трехвалентную форму. Образующийся метгемоглобин не способен осуществлять обратимое связывание кислорода. В результате нарушается транспортная функция гемоглобина и кислород поступает в ткани в недостаточном количестве, что приводит к развитию гипоксии.

В опытах на животных установлена возможность тератогенного (рождение мертвых детей) и эмбриотоксического (отравление плода в утробе матери) действия нитратов. Дискутируется вопрос о их мутагенности.

В последние годы на первый план выходит другой аспект связанный с поступлением нитратов в организм. Установлено, что нитраты при взаимодействии с аминами и амидами могут являться причиной возникновения канцерогенных N-нитрозоаминов. Основным нитрозирующим соединением является нитрит, а потенциальным – нитрат. Следовательно, те условия, которые благоприятствуют образованию нитрита, способствуют образованию нитрозосоединений. В ряде стран установлена прямая корреляция между количеством применяемых азотных удобрений и смертностью от рака желудка.

Согласно последним данным прямое канцерогенное воздействие может оказывать и нитрит.

Особенно опасно отрицательное воздействие нитратов для детей Это связано во-первых, с интенсивным ростом, а во-вторых с физиологическими особенностями детского организма (содержание гемоглобина, рН желудочного сока и т.д.).

В целом при хроническом отравлении нитратами, вызванном длительным их поступлением в малых дозах возникают патологические изменения ряда внутренних органов, снижение иммунитета организма, что сопровождается ухудшением аппетита, исхуданием, развитием анемии, нарушением свертываемости крови. Создаются предпосылки для развития злокачественных опухолей. При длительном воздействии нитратов на организм даже на уровне малых концентраций, наблюдается повреждение мужских половых клеток, что в конечном итоге нарушает генетическую характеристику и функции воспроизводства.

Острое отравление может развиваться при активном употребле­нии овощей, соков, мясной и рыбной продукции, воды с высоко ii концентрацией содержания нитратов и нитритов и проявляется через 4-6 часов после их поступления. Появляется цианоз (синюшность) губ, слизистых оболочек, ногтей, лица. Вследствие раздражающего действия нитратов на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, возможны проявления тошноты, рвоты, слюновыделение и понос.

Выраженными симптомами со стороны нервной системы являются: общая слабость, сильная головная боль в затылочной части, сонливость (у детей беспокойство), головокружение, нарушение координации движений.

В тяжелых случаях наблюдаются судорожные подергивания, потеря сознания, коматозное состояние.

Количество нитратов поступающих в организм человека в сутки может варьировать в очень широких пределах, что зависит от на­циональных особенностей, рациона питания, времени года и т.д.

Порогом хронического действия нитратов является доза 5,9 мг/кг. Смертельной дозой нитратов для человека считают 80-300 мг/кг веса тела. Для взрослого человека со средней массой тела это составляет 5,1-21 г нитратов, для детей грудного возраста - от 2 дл 3 г. Предельно допустимая суточная норма поступления нитратов в организм человека установленная Минздравом РБ составляет 5 миллиграмм на килограмм веса. Что бы не допустить превышение суточной нормы нитратов, установлены предельно допустимые уровни их содержания (ПДУ) для основных продуктов питания