Постоянные микротомные препараты

Исследование микротомных препаратов сыграло огромную роль в развитии цитологии и эмбриологии растений. Многие отече­ственные ученые, начиная с С.Г. Навашина, сделали очень цен­ные наблюдения на постоянных микротомных препаратах. Эти препараты являются прекрасным демонстрационным материа­лом и могут храниться долгие годы. На тонких срезах толщиной 10-22 мкм можно изучать митоз и мейоз, подсчитывать число хромосом, наблюдать проникновение пыльцевых трубок в заро­дышевый мешок, двойное оплодотворение, развитие зародыша, эндосперма и т. д.

Техника приготовления окрашенных микротомных препара­тов для растений введена В.И. Беляевым. Объекты, предназначенные для таких исследований, претерпевают сложную обра­ботку. Ниже приведена последовательность обработки исследуе­мого материала по Юрцеву.

1. Подготовка материала к фиксации.

1. Фиксирование материала водным (24 ч) или спиртовым фиксатором (30 мин—12 ч).

2. Промывка фиксированного материала:

после водных фиксаторов	после спиртовых фиксаторов
в проточной воде 1-3 ч	в 3 сосудах с 80%-м р-ром этилового спирта по 1-2 ч в каждом (запах уксусной кислоты должен исчезнуть)

4. Полное обезвоживание промытого материала;

5. Пропитывание материала растворителями парафина (хло­роформом, ксилолом или бензолом):

5. Пропитывание материала парафином (замещение промежуточной жидкости парафином): в хлороформ (или ксилол) добавляют парафин и эту смесь помещают в термостат при температуре 56-57 °С до полного испарения хлороформа (или ксилола) и замещения его в материале парафином в течение 3-6 сут.

6. Заливка материала в парафин (материал, залитый в парафин, можно хранить очень долго).

7. Изготовление блоков из материала, пропитанного парафином.

5. Получение срезов при помощи микротома.

10. Наклейка срезов на предметные стекла.

11. Просушивание препарата при 40-45°С (стекла со срезами можно хранить очень долго, если оберегать их от пыли и высокой температуры).

11. Удаление парафина, из срезов ксилолом.

12. Удаление ксилола из срезов спиртом.

13. Удаление спирта из срезов дистиллированной водой.

11. Окрашивание препаратов (иногда с предварительным протравливанием) и дифференцировка.

12. Обезвоживание окрашенных срезов 96%-м раствором и 100%-м этиловым спиртом.

13. Замещение спирта в срезах на ксилол (одновременно происходит осветление срезов ксилолом).

11. Заключение срезов в канадский бальзам.

12. Просушивание препаратов и подчистка.

13. Этикетирование препаратов.

14. Изучение препаратов под микроскопом.

Подбор объектов для исследования и подготовка их к фиксации

Для цитологических и эмбриологических исследований очень важно определить, какие органы и ткани растения необходимы для работы. Например, митоз можно наблюдать в меристемах молодых быстрорастущих корней растений, в главных корнях проросших семян, в конусах нарастания стебля и др. Обычно для изучения митоза и подсчета числа хромосом в соматических тканях растения предпочитают работать с молодыми корнями, так как в них непосредственно под чехликом находится зона активного деления клеток (конус нарастания корня) и фигуры деления здесь удобно ориентированы.

Для изучения мейоза и подсчета числа хромосом во время деления материнских клеток микроспор используют у расте­ний семейства мятликовые – молодые колосья за несколько дней до выколашивания, мотыльковые и некоторые другие – неболь­шие бутоны до приобретения ими окраски или непосредственно молодые пыльники. Оплодотворение и различные этапы эмбрио­генеза наблюдают в опыленных цветках через определенные промежутки времени после нанесения пыльцы на рыльце.

Имея необходимые объекты для исследования, нужно обра­тить серьезное внимание на их подготовку к фиксации. От этого во многом зависит достоверность эксперимента. Например, что­бы наблюдать деление клеток в кончиках молодых корней» очень важно обеспечить соответствующую температуру воздуха, влажность среды, а в полевых условиях – еще почвенное пита­ние и освещение, т. е. создать оптимальные условия для нормаль­ного роста и развития растений. Отсутствие необходимых усло­вий тормозит рост растений и деление клеток.

В специальных исследованиях иногда необходимо не только наблюдать деление клеток в конусе нарастания корня, но и оп­ределить время наступления первых митозов. Установлено, что при одной и той же температуре (23-25°С) первые митозы у проросших семян различных видов растений наблюдаются в ко­решках неодинаковой длины. Например, у скерды зеленой (Сrepis capitlaris (L.) Wallr.) они бывают в корешках длиной 2-3 мм, у бобов (Vicia faba L.) – 12-17, у мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) – 10-12 мм. Следовательно, при подготовке корней к фиксации следует обращать внимание на их длину.

Подмечено также, что число делящихся клеток в различные часы суток неодинаково. Это заставляет учитывать в ряде слу­чаев, периодичность митозов и проводить фиксацию материала в разное время с определенными интервалами в зависимости от объекта.

Как указывалось выше, для изучения митоза и подсчета чис­ла хромосом можно брать проросшие семена и растения, выра­щенные в вазонах или непосредственно в полевых условиях. Если семян достаточно, их проращивают в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге. Чашки Петри с семенами по­мещают в термостат с температурой воздуха 23-25 °С или в теплое место, например под лампу. Корни могут появиться через несколько суток, в течение которых необходимо следить за тем, чтобы фильтровальная бумага была влажной. В ряде случаев целесообразно менять температуру при проращивании семян (ночью 27°С, днем 0-2°С).

Фиксируют корни, когда длина их достигнет в зависимости от объекта 3-15 мм. Если нужно зафиксировать корни во вре­мя первых митозов, то их берут только определенной для данной культуры длины. Максимум митозов неодинаков в корнях раз­ной длины. Так, у бобов он отмечен в корнях, достигших длины 1-1,5 см, у гороха – 1,5-2, у гречихи – 1-2, у ржи – 1,5 см и т. д. В некоторых случаях фиксируют не отдельно корни, а проросшие семена целиком, например у мелкосемянных куль­тур – скерды зеленой, лука.

Растения, выращиваемые в небольших вазонах диаметром 10-12 см, лучше помещать на освещенное место в теплице. Почва в вазонах не должна быть плотной. Чтобы предотвратить высыхание и создать благоприятные условия для растущих кор­ней, вазоны ставят в ящики с влажной почвой и систематически поливают. Через 2-3 недели после посева семян в вазоне на поверхности земляного кома появляются многочисленные моло­дые корни, которые отрезают ножницами и сразу помещают в фиксатор.

Иногда нужно зафиксировать корни растений, растущих в по­левых условиях. В этом случае растения также нужно заранее подготовить, полить, удобрить навозом, подрыхлить. Подготовленные экземпляры подкапывают с одной стороны, находят мо­лодые корни и отрезают их ножницами. Фиксировать их лучше в тени во избежание преждевременной порчи обнаженных кор­ней на солнце.

В. ряде случаев возникает необходимость подсчитать число хромосом у растений, размножающихся луковицами, клубнями, черенками и т. д. Для этого черенки, листья, луковицы поме­щают в сосуд с водой или с искусственной питательной смесью} а клубни – в мокрый песок.

Для наблюдения процессов оплодотворения и формирования зародыша цветки заранее кастрируют, опыляют и фиксируют через определенные промежутки времени после нанесения пыль­цы на рыльце. Для такого опыта важно обеспечить сравнимость, результатов.