- •4.7. Осаждение белков фенолами
- •4.8. Осаждение белков алкалоидными реактивами
- •4.9. Осаждение белков органическими растворителями
- •1. Цель работы
- •2. Задание
- •3. Теоретическая часть
- •Краткая характеристика нуклеиновых кислот клеток высших организмов
- •2.4. Определение сиаловых кислот в сыворотке крови методом Гесса.
- •4.4. Определение сиаловых кислот в сыворотке крови методом Гесса
- •2.1. Гидролиз казеина и определение в гидролизате фосфорной кислоты
- •4.1. Гидролиз казеина и определение в гидролизате фосфорной кислоты
- •1. Цель работы
- •2. Задание
- •2.1. Определение прочности связи между белковым и липидным компонентами липопротеидов ткани печени по качественной пробе л. Делямуре
- •2.2. Сделать выводы и оформить отчет.
- •3. Теоретическая часть
- •4.1. Определение прочности связи между белковым и липидным компонентами липопротеидов ткани печени по качественной пробе л. Делямуре
4.4. Определение сиаловых кислот в сыворотке крови методом Гесса
Ход работы
Сиаловые кислоты представляют собой N-ацетил- и N-глицилпроизводные нейраминовой кислоты. Эти соединения рассматриваются как нормальные компоненты всех тканей и биологических жидкостей организма человека и животных и являются важной составной частью углевод-белковых (гликопротеинов) и углевод-липидных (гликолипидов) комплексов, в которых занимают обычно краевое положение. После отщепления от гликопротеидов свободные сиаловые кислоты инактивируют многие бактериальные и вирусные болезнетворные агенты. Поэтому увеличение содержания в крови сиалогликопротеинов может быть проявлением компенсаторной, защитной воспалительной реакции. В свободном виде производные нейраминовой кислоты присутствуют в крови, слизистой оболочке желудка, щитовидной железе и др.
Для определения концентрации сиаловых кислот в сыворотке крови обычно используется колориметрический метод Гесса. При этом безбелковый фильтрат сыворотки крови подвергают гидролизу, в результате чего из состава сиалогликопротеидов выделяются сиаловые кислоты, которые взаимодействуя с уксусной и серной кислотами в условиях повышенной температуры, создаваемой в кипящей водяной бане, дают окрашенные соединения, изменяющие цвет раствора в буровато-розовый или красно-фиолетовый. При этом интенсивность окрашивания зависит от концентрации сиаловых кислот.
В центрифужную пробирку наливают 1 мл сыворотки крови и, осторожно встряхивая, добавляют 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Пробирку помещают на 5 минут в кипящую водяную баню, затем охлаждают обычно путем выдерживания ее в течение 5 минут в ледяной бане или холодной воде, центрифугируют 5 минут при 1000-2000 об/мин. К 0,4 мл отобранной надосадочной жидкости добавляют 5 мл уксусно-сернокислой смеси и пробы повторно нагревают в кипящей водяной бане в течение 30 минут. При этом бесцветный раствор постепенно приобретает красно-фиолетовый цвет. После охлаждения в ледяной бане или под струей холодной воды пробы колориметрируют на ФЭКе с зеленым светофильтром в кювете с шириной слоя 10 мм. В качестве контроля используют 5% раствор серной кислоты в ледяной уксусной кислоте.
Результат выражают либо в условных единицах (при отсутствии стандартного раствора), для чего полученную величину экстинкции умножают на 1000, либо в значениях концентрации ацетилнейраминовой кислоты. В последнем случае расчет ведут по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. Из основного стандартного раствора N-ацетилнейраминовой кислоты готовят рабочие растворы, как показано в таблице 7:
Приготовление рабочих растворов Таблица 7.
№ пробирки |
Рабочие стандартные растворы, мл |
Концентрация нейраминовой кислоты в пробе |
||
Основной стандартный раствор N-ацетилней-раминовой кислоты |
Дистиллированная вода |
мг% |
ммоль/л |
|
1 |
0,10 |
0,30 |
25,0 |
0,80 |
2 |
0,15 |
0,25 |
37,5 |
1,21 |
3 |
0,20 |
0,20 |
50,0 |
1,61 |
4 |
0,25 |
0,15 |
62,5 |
2,02 |
5 |
0,30 |
0,10 |
75,0 |
2,42 |
6 |
0,40 |
- |
100,0 |
3.23 |
К растворам прибавляют 5 мл уксусно-сернокислого реактива и обрабатывают их так же, как опытные пробы.
В норме содержание сиаловых кислот составляет 135-200 усл.ед., или 62-73 мг% (0,62-0,73 г/л), или 2,00-2,36 ммоль/л N-ацетилнейраминовой кислоты. При инфекционных, аллергических состояниях и некробиотических процессах нарушается тканевой метаболизм с деполимеризацией гликопротеиновых комплексов. В результате этих изменений в сыворотке крови в большом количестве появляются продукты расщепления белково-углеводных комплексов и в связи с этим резко нарастает доля сиаловых кислот. Гиперсиалемия (повышение уровня сиаловых кислот в сыворотке крови) наблюдается при опухолях головного мозга, инфаркте миокарда, ревматизме, туберкулезе, раке, эндокардите, лейкемии, лимфогранулематозе, нефротическом синдроме, остеомиелите и других заболеваниях (преимущественно воспалительного характера, а также сопровождающихся распадом соединительной ткани). У больных с активным туберкулезом содержание нейраминовых кислот нередко составляет 5,74 ммоль/л, с подострым бактериальным эндокардитом – 3,3 ммоль/л, с далеко зашедшей раковой опухолью – 4,58 ммоль/л. Их концентрация возрастает также при заболеваниях, связанных с поражением паренхимы печени и коллагенозах.
Гипосиалемия или снижение доли сиаловых кислот в крови отмечается при пернициозной анемии, гемохроматозе, болезни Вильсона-Коновалова и дегенеративных процессах в центральной нервной системе, что, видимо, связано с нарушением биосинтеза гликопротеиновых комплексов.
5. СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА
Отчет составляется с указанием цели, задания, экспериментальные данные и выводы.
6. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПРОВЕРКИ
6.1. Дайте определение гликопротеидам и назовите соединения, входящие в состав их небелковой части.
Как и по какому принципу можно классифицировать все углевод-белковые комплексы?
Какие типы связей обнаруживаются между белковым и углеводным компонентами в гликопротеидах?
Какова биологическая роль гликопротеидов в организме?
Какие качественно новые свойства белковой молекуле придает углеводная группировка?
Что такое гликозаминогликаны? В какой ткани обнаруживается наибольшее количество этих соединений?
Какие продукты образуются при гидролизе небелковой части гликопротеидов? Какими качественными реакциями можно их обнаружить?
6.8. Что такое серомукоиды плазмы крови? Какие соединения относятся к этой группе веществ?
6.9. В чем заключается принцип турбидиметрического метода определения серомукоидов в сыворотке крови? Значение количественного определения серомукоидов в сыворотке крови?
Что такое сиаловые кислоты и какова их роль в организме?
Каковы принцип и химизм количественного определения сиаловых кислот в сыворотке крови методом Гесса? Значение количественного определения уровня сиаловых кислот в сыворотке крови.
6.12. Какая реакция является качественной на углеводы?
6.13. Какие ткани в живых организмах содержат большое количество гликопротеидов?
ФОСФОПРОТЕИДЫ
1. ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить состав и строение фосфопротеидов.
2. ЗАДАНИЕ