ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ.

1. ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучить физико-химические свойства белков и реакции осаждения белков.

2. ЗАДАНИЕ

2.1. Определить изоэлектрическую точку белка казеина.

2.2. Провести разделение альбуминов и глобулинов яичного белка методом высаливания.

2.3. Провести осаждение белков при нагревании

2.4. Провести осаждение белков солями тяжелых металлов.

2.5. Провести осаждение белков минеральными кислотами.

2.6. Провести осаждение белков органическими кислотами

2.7. Осаждение белков фенолами

2.8. Осаждение белков алкалоидными реактивами

2.9. Осаждение белков органическими растворителями

2.10. Сделать выводы и оформить отчет.

3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Белки являются высокомолекулярными соединениями, так как в их состав входят сотни и тысячи атомов. Например, чистый β-лактоглобулин имеет следующий элементарный состав: С₁₈₆₄Н₃₀₁₂О₅₇₆N₄₁₈S₂₁. Все белки в зависимости от их строения делятся на две группы: фибрилярные и глобулярные. Фибриллярные белки имеют форму тончайших нитей. Они входят в состав мышц (миозин), сухожилий (коллаген, эластин), кожи, шерсти и т. д. Большинство из них не растворимы в воде. Глобулярные белки имеют округлую форму. К ним относятся альбумины, глобулины, гемоглобин и др. Они растворяются в воде и солевых растворах.

Белки состоят из аминокислот и поэтому обладают амфотерными свойствами. При растворении белков в воде ион водорода, появляющийся в результате диссоциации карбоксильной группы, присоединяется к аминогруппе. Поэтому белковые молекулы несут как положительные, так и отрицательные заряды. Величина заряда определяется количеством ионогенных групп. При определенном значении рН суммарный электрический заряд молекулы белка становится равным нулю. Такое значение рН называется изоэлектрической точкой (рJ). В изоэлектрической точке растворы белков имеют минимальную устойчивость, поскольку они лишены основного стабилизирующего фактора – заряда и поэтому легко выпадают в осадок. Определить изоэлектрическую точку белка можно, определив рН, при котором раствор белка имеет наибольшее помутнение.

У большинства белков изоэлектрическая точка лежит в слабокислой среде. Растворение белка объясняется его гидратацией, т. е. образованием водной оболочки из ориентированных молекул воды. При этом образуются коллоидные растворы. Такие растворы являются неустойчивыми. При добавлении к ним каких-нибудь водоотнимающих веществ (концентрированных растворов солей, спирта и т. д.) гидратация уменьшается, следовательно, уменьшается и растворимость белка. Белок выпадает в осадок. Процесс выпадения белка в осадок под действием водоотнимающих средств называется высаливанием. При высаливании происходит дегидратация белковых молекул. На процесс высаливания влияет ряд факторов: гидрофильность белка, заряд катиона и аниона соли и т. д. Поэтому различные белки высаливаются при различной концентрации одних и тех же солей. Этим пользуются для разделения белков на различные фракции. Так, глобулины, имеющие относительную массу больше, чем альбумины, осаждаются полунасыщенным раствором сульфата аммония (NH₄)₂SO₄, а альбумины – его насыщенным раствором.

Существует большое количество реакций осаждения белков. Условно их можно разделить на 2 группы: 1) необратимые, при которых белки претерпевают глубокие изменения и не могут вновь растворяться в первоначальном растворителе, т.е. наступает денатурация белков. К необратимым реакциям относятся осаждение белка солями тяжелых металлов, алкалоидными реактивами, минеральными и органическими кислотами и осаждение при нагревании; 2) обратимые, при которых осаждаемые белки не подвергаются глубоким изменениям, поэтому осадки белков могут растворяться в первоначальном растворителе. К обратимым реакциям осаждения следует отнести осаждение белков органическими растворителями (спиртом или ацетоном) и высаливание (осаждение под влиянием концентрированных растворов нейтральных солей: NH₄Cl, NaCl, (NH₄)₂SO₄ и др.).

Осаждение белков различными солями зависит от их дегидратирующей способности, в частности хлорид натрия осаждает белки слабее, чем сульфат аммония. Высаливание белков является обратимым процессом, т. е. при высаливании способность белков к растворению не теряется. При прибавлении достаточного количества воды белок снова может раствориться. Денатурация белка, в отличие от высаливания, является необратимым процессом. При денатурации происходит разрушение третичной и частично вторичной структуры белковой молекулы в результате разрыва водородных связей. При денатурации в той или иной мере происходит изменение формы и размеров молекулы, изменение реактивности некоторых химических групп, уменьшение растворимости, уменьшение или полная потеря специфической биологической активности, изменение удельной оптической активности. При денатурации изменяется строение поверхностного слоя белковых частиц, в результате чего на поверхность выходят гидрофобные (не растворимые в воде) группы. Денатурацию вызывают различные физические (нагревание, действие ультрафиолетовых лучей и т. д.) и химические (соли тяжелых металлов, минеральные и органические кислоты и т. д.) факторы. Соли тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) вызывают денатурацию белков даже в очень малых концентрациях.

Взаимодействуя с белками, ионы тяжелых металлов адсорбируются на них, образуя соединения, растворимые в избытке солей (за исключением солей AgNO₃, HgCl₂), но не растворимые в воде. Концентрированные минеральные кислоты тоже вызывают денатурацию белковых молекул. Происходит образование комплексных солей белка с кислотами (за исключением фосфорной кислоты). В избытке всех минеральных кислот (исключая азотную) выпавший осадок белка растворяется. Денатурированные частицы белка способны к агрегации и выпадению в осадок, но коагуляция является вторичным процессом по отношению к денатурации, поэтому денатурация белка не всегда сопровождается выпадением осадка. Так, если проводить нагревание сильно подкисленных или подщелоченных растворов белка, то осадка не образуется. Это объясняется тем, что на молекулах белка появляются одноименные заряды (+ или –), которые препятствуют объединению частиц в агрегаты. Заряд на поверхности белковых молекул является одним из основных стабилизирующих факторов.

Роль реакций осаждения белка заключается в том, что они дают возможность изучить свойства белков, освободить жидкость от присутствия белка при некоторых исследованиях, установить наличие белка (например, в моче) при различных патологических состояниях (заболевания почек, сердечная декомпенсация и др.). Осаждение белков высаливанием с помощью различных концентраций сернокислого аммония или других нейтральных солей позволяет разделить отдельные белковые фракции – альбумины и глобулины.

Некоторые реакции осаждения белков используют в лечебной практике (например, при лечении ожогов, когда белки осаждают таннином или спиртом). При отравлениях солями тяжелых металлов рекомендуется дать пострадавшему выпить раствор яичного белка или молоко, белки которых связывают эти металлы и предупреждают их всасывание.

4. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

4.1. Определение изоэлектрической точки белка казеина

Изоэлектрической точкой белка (ИЭТ или pI) называется определенная величина рН среды, при которой белок находится в виде нейтральных молекул (в изоэлектрическом состоянии), несущих равные количества положительных и отрицательных зарядов. При других концентрациях ионов водорода в растворе присутствуют преимущественно положительные или отрицательные ионы белка. Растворы белков в изоэлектрической точке наименее устойчивы и легко выпадают в осадок. Для большинства белков эта точка близка к нейтральной среде, но не вполне совпадает с ней (pI белков лежат в области рН 6-8); для многих белков она сдвинута в кислую сторону (альбумины pI = 4,6; пепсин pI = 1,5-2,0), а некоторые имеют изоэлектрическую точку при щелочной реакции среды (гистоны pI = 8,5).

Отыскать изоэлектрическую точку белка можно, определив рН раствора, при котором наблюдается наиболее быстрое и полное выпадение белка в осадок.

Ход работы

0,01 г казеина помещают в пробирку и растворяют при нагревании примерно в 2-3 мл 0,4% раствора соды. При этом образуется сильно опалесцирующий коллоидный раствор, к которому добавляют 10 мл дистиллированной воды.

В шести пронумерованных пробирках приготавливают буферные смеси с различными значениями рН, смешивая 0,2 М раствор уксусной кислоты и 0,2 М раствор уксуснокислого натрия в соотношениях, указанных в таблице 1 (растворы точно отмеривают пипеткой или бюреткой).

Приготовление буферных растворов Таблица 1.

Реактивы	Пробирки
	1	2	3	4	5	6
0,2М СН3СООН, мл	0,1	0,2	0,5	0,8	0,9	0,95
0,2М СН3СООNа, мл	0,9	0,8	0,5	0,2	0,1	0,05
рН смеси	5,7	5,35	4,75	4,15	3,8	3,4
Интенсивность помутнения раствора

Раствор в пробирках взбалтывают, затем в каждую добавляют по 0,5 мл приготовленного (как указано выше) 0,1% раствора казеина. Содержимое каждой пробирки вновь перемешивают и отмечают в таблице интенсивность помутнения: знаком +++ - наиболее сильное, ++ - менее сильное, + - слабое, - - отсутствие помутнения. Наибольшее помутнение в результате выпадения осадка белка будет наблюдаться в той пробирке, где рН соответствует изоэлектрической точке (рJ) казеина. Результаты работы оформляют в виде таблицы и делают вывод.

4.2. Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка методом высаливания

Яичный белок состоит из нескольких белков, отличающихся друг от друга по растворимости. При помощи метода высаливания из него можно выделить альбумины и глобулины.

Ход работы

4.2.1. К 20 каплям неразбавленного яичного белка добавляют сухую соль хлорида натрия до насыщения раствора, т. е. до того момента, когда соль перестанет растворяться. Выпадает белый аморфный осадок глобулинов. Через 10–12 мин произойдет их полное осаждение. После этого осадок отфильтровывают через бумажный фильтр. Пробирку с фильтратом кипятят или проводят с ее содержимым биуретовую реакцию. Отрицательная реакция указывает на отсутствие белка, положительная – на его присутствие. Делают вывод о наличии белка в фильтрате.

4.2.2. К 20 каплям неразбавленного яичного белка добавляют 20 капель насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. Получается полунасыщенный раствор сульфата аммония, в котором выпадает осадок яичного глобулина. Через 5–10 минут осадок отфильтровывают. В фильтрате остается яичный альбумин. Для его высаливания к фильтрату прибавляют сухую соль сульфата аммония до полного насыщения раствора. Выпавший осадок альбумина отфильтровывают, а фильтрат кипятят или проводят с ним биуретовую реакцию. Отрицательная реакция указывает на отсутствие белка. Делают вывод о высаливающей способности хлорида натрия и сульфата аммония.

4.3. Осаждение белков при нагревании в разных средах

Почти все белки при нагревании выше 55°С денатурируют. Механизм тепловой денатурации связан с перестройкой структуры белковой молекулы, в результате которой белок теряет свои нативные свойства, уменьшается его растворимость вследствие разрушения гидратной оболочки. Присутствие нейтральных солей и изменение рН среды имеют важное значение в осаждении белка при нагревании. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в его изоэлектрической точке, т.е. при такой величине рН, когда коллоидные частицы белка наименее устойчивы. Поэтому для полного осаждения белка при нагревании реакция среды должна соответствовать его изоэлектрической точке. Белки обладающие кислыми свойствами, полнее осаждаются в слабокислой, щелочными свойствами – в слабощелочной среде. В сильнокислых (за исключением осаждения азотной, трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот) и сильнощелочных растворах денатурировавший при нагревании белок не выпадает в осадок, так как частицы его перезаряжаются и несут в первом случае большой положительный, во втором – большой отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе за счет электростатических сил отталкивания. В связи с этим в вышеназванных растворах белки обычно не выпадают в осадок при нагревании. Однако в сильнокислых растворах при нагревании они могут коагулировать, если добавить достаточное количество какой-либо нейтральной соли. Степень влияния ионов нейтральных солей на осаждаемость белка зависит от их способности адсорбироваться на его частицах. Адсорбированные ионы соли нейтрализуют заряд частицы, и наступает момент, когда силы притяжения между молекулами превышают силы отталкивания, вследствие чего белок выпадает в осадок.

Ход работы

В пять пронумерованных пробирок наливают по 5-10 капель 1% раствора яичного белка, который должен быть абсолютно прозрачным.

Содержимое первой пробирки нагревают и наблюдают за появлением опалесценции, которая хорошо видна, если рассматривать раствор на черном фоне и иметь для сравнения пробирку с исходным раствором белка. Усиление опалесценции объясняется укрупнением взвешенных частиц белка. При нагревании раствора усиливается движение белковых частиц и повышается частота их столкновений. По мере сближения частиц начинают действовать силы притяжения, частицы соединяются, образуя агрегаты молекул, что вызывает увеличение рассеивания света.

К раствору яичного белка во второй пробирке осторожно приливают одну каплю 1% раствора уксусной кислоты, нагревают и наблюдают сначала появление опалесценции, а потом выпадение белого хлопьевидного осадка. К раствору яичного белка в третьей пробирке добавляют 1-2 капли 10% раствора уксусной кислоты и нагревают. Осадок при этом не образуется. В четвертую пробирку добавляют 1-2 капли 10% уксусной кислоты и 1 каплю насыщенного раствора хлористого натрия, нагревают и наблюдают выпадение осадка белка. В пятую пробирку вносят 1 каплю 10% раствора едкого натра и нагревают. В данном случае осадок не выпадает.

Все пять пробирок нагревают на водяной бане. Наблюдают за изменениями, которые в них происходят. Определяют, в каких пробирках и в какой последовательности происходит помутнение. Результаты опыта и выводы записывают в таблице 2.

Результаты опытов Таблица 2.

№ пробирки	Среда	Наблюдаемые изменения	Выводы
1	Слабокислая (1% СН3СООН)
2	Кислая (10% СН3СООН)
3	Слабокислая (1% CH3COOH + NaCl)
4	Щелочная (10% NaOH)
5	Нейтральная

4.4. Осаждение белков солями тяжелых металлов

Осаждение белков солями тяжелых металлов вызывает денатурацию белковой молекулы и обусловлено адсорбцией тяжелого металла на поверхности белковой молекулы с образованием нерастворимых в воде солеобразных и комплексных соединений.

Ход работы

В три пробирки вносят по 5 капель 1% раствора яичного белка и по 1 капле в первую пробирку – 7% раствора сульфата меди, во вторую – 5% раствора уксуснокислого свинца, в третью – 5% раствора нитрата серебра. Во всех пробирках образуется осадок. Затем в каждую из пробирок добавляют по 5-10 капель соответствующего раствора соли тяжелого металла. При этом в двух первых пробирках наблюдается растворение осадка, в третьей осадок не растворяется.

Делают вывод о том, в избытке каких солей осадок растворяется.

4.5. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

Осаждение белка из раствора концентрированными минеральными кислотами обусловлено его дегидратацией и последующей денатурацией. При длительном воздействии избытка серной и соляной кислот выпавший осадок денатурировавшего белка растворяется вследствие частичного гидролиза. При избытке азотной кислоты растворения осадка не происходит.

Осаждают белки концентрированными минеральными кислотами наслаиванием на кислоты раствора белка. При этом образуется осадок, который растворяется при смешивании жидкостей.

Реакция наслаивания на кислоту раствора белка очень чувствительна, так как вследствие диффузии жидкостей устанавливается наиболее благоприятная для данной реакции концентрация реагирующих веществ.

Проба Хеллера (осаждение белков азотной кислотой) используется для определения наличия белка в моче. Эта качественная реакция лежит в основе количественного определения белка в моче по методу Робертса-Брандберга-Стольникова.

Ход работы

В первую пробирку наливают 10-20 капель концентрированной азотной, во вторую – столько же концентрированной соляной, в третью – такое же количество концентрированной серной кислоты. Затем, наклонив пробирку, осторожно по ее стенке пипеткой наслаивают равный объем 1% раствора яичного белка, следя за тем, чтобы обе жидкости не смешивались. В области соприкосновения жидкостей образуется белый аморфный слой белка. В каждую пробирку добавляют избыток соответствующей кислоты. Наблюдают растворение осадка в избытке серной кислоты.

4.6. Осаждение белков органическими кислотами

Органические кислоты вызывают необратимое осаждение белков. Чаще всего используют растворы трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот. Названные кислоты специфичны к белку и широко используются для определения наличия его в моче, экссудатах и других жидкостях организма человека. Сульфосалициловая кислота широко используется в клинике для обнаружения малых количеств белка в моче и других биологических жидкостях. Кроме белков она осаждает также продукты их распада – высокомолекулярные пептоны и полипептиды. Трихлоруксусная кислота (ТХУ) способна осаждать только белки и не осаждает продукты их распада. В связи с этим она широко используется в клинике для получения безбелковых фильтратов крови, например, для определения остаточного (небелкового) азота или среднемолекулярных пептидов.

Ход работы

В две пробирки наливают по 10 капель 1% раствора яичного белка. В одну из них добавляют 2-3 капли свежеприготовленного 10% раствора трихлоруксусной, в другую – 1 каплю 10% раствора сульфосалициловой кислоты, наблюдая за выпадением осадка.

4.7. Осаждение белков фенолами

Ход работы

В пробирку наливают 10 капель раствора белка и добавляют при взбалтывании фенол до появления мути или осадка. При стоянии пробирки осадок увеличивается.

4.8. Осаждение белков алкалоидными реактивами

К группе алкалоидных реактивов принадлежат танин, пикриновая кислота, железосинеродистая кислота, фосфорновольфрамовая, фосфорномолибденовая кислота и др. Механизм осаждения белков алкалоидными реактивами связан с образованием нерастворимых солеобразных соединений с основными азотсодержащими группами белка. В этих соединениях белок является катионом, а алкалоид – анионом. Для сообщения белку положительного заряда рекомендуется слабое подкисление его раствора уксусной кислотой. Протамины и гистоны, несущие положительный заряд, хорошо осаждаются алкалоидными агентами в нейтральной среде без подкисления. Алкалоиды нашли применение при лечении ожогов. Обработка ими пораженной области приводит к денатурации белков и образованию защитного слоя, препятствующего обезвоживанию тканей и проникновению инфекции.

Ход работы

В три пробирки наливают по 5 капель 1% раствора яичного белка, по 1 капле 1% раствора уксусной кислоты и по 2-3 капли в первую пробирку – 10% раствора пикриновой кислоты, во вторую – насыщенного раствора танина, в третью – 5 % раствора железосинеродистого калия. Во всех пробирках белок выпадает в осадок.

4.9. Осаждение белков органическими растворителями

Белки не растворяются во многих органических растворителях (спирте, ацетоне, эфире и др.). В зависимости от природы белка для его осаждения требуются различные концентрации спирта. Органические растворители связывают воду и вызывают дегидратацию мицелл белка, тем самым понижая его устойчивость в растворе. При этом осаждаются белки только из нейтральных и слабокислых растворов, особенно в присутствии электролитов (ионы соли связываются коллоидными частицами белка и снимают заряд).

Кратковременное воздействие органических растворителей сохраняет белок в естественном состоянии; при продолжительном взаимодействии со спиртом он подвергается денатурации.

Ход работы

В пробирку наливают 5 капель 1% раствора яичного белка и 20 капель спирта или ацетона, в результате чего раствор мутнеет. При добавлении нескольких капель насыщенного раствора хлорида натрия выпадает осадок белка. Результаты проведенных опытов записываются в форме таблицы 3.

Результаты опытов Таблица 3.

Группа осадителей	Реактивы	Характер и цвет осадка	Чем обусловлена реакция
1	2	3	4

5. СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Отчет составляется с указанием цели, задания, включая экспериментальные данные, таблицы и выводы.

6. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПРОВЕРКИ

6.1. Какие уровни структурной организации белковой молекулы Вы знаете? Какие связи участвуют в их стабилизации?

6.2. Что такое денатурация белка? Какие уровни структурной организации при этом разрушаются?

3. Какие денатурирующие агенты Вам известны? Какие связи в молекуле белка они преимущественно разрушают?

6.4. От чего зависит растворимость белка? Какие факторы стабилизируют белок в растворе?

5. Что понимают под обратимым и необратимым осаждением белков? Какие реакции осаждения белков являются обратимыми? Какие реакции осаждения белков необратимы?

6. Чем обусловлены необратимые реакции осаждения белков? Применение их в медицинской практике.

7. Будет ли коагулировать белок из раствора в присутствии избытка кислоты или щелочи? Почему?

6.8. Будет ли происходить осаждение белка при действии: 1) низких концентраций раствора хлорида натрия; 2) высоких концентраций раствора хлорида натрия; 3) низких концентраций раствора хлорида ртути?

9. Что такое высаливание белков? Для каких целей используется высаливание в медицине?

10. Чем обусловлен заряд белковой молекулы в растворе?

11. Дайте определение изоэлектрической точке белка. Как можно определить ИЭТ белка?

12. Определите направление движения белка с pI = 4,6 при фракционировании методом электрофореза в буферном растворе с рН = 8,2.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ