Количественный метод определения содержания белка на полуавтоматическом приборе кьельтек (Швеция)

В основу метода положен классический метод Кьельдаля, который основан на минерализации органических соединений биологических объектов с последующим определением общего азота по количеству образовавшегося аммиака.

Полуавтоматический прибор состоит их блоков: сжигания, минерализации, титрования.

Порядок работы включает основные этапы: подготовка пробы; отбор образца для анализа; минерализация/сжигание образца; дистилляция и титрование дистиллята.

Основные процессы, происходящие при количественном методе определения белка:

1.Минерализация с нагревом исследуемого образца в присутствии концентрированной серной кислоты и катализатора;

2.Образование в процессе минерализации аммиака и вступление его в реакцию с избытком концентрированной серной кислоты с образованием сульфата аммония;

3.Разложение сульфата аммония до аммиака с использованием гидроксида натрия;

Поглощение выделившегося аммиака раствором серной кислоты точной концентрации;

4.Оттитровывание избытка серной кислоты гидроксидом натрия;

5.Определение количества поглощенного аммиака и соответствующее ему количество азота по количеству связанной кислоты;

6.Рассчет массовой доли белка по полученному количеству азота с использованием коэффициента пересчета на белок, зависящего от вида сырья или продукта.

Коэффициент пересчета для мяса, мясопродуктов, хлеба, рыбы, животных кормов, сои, гороха составляет -6,25.

Для количественного метода определения белка приготавливаются следующие реактивы:

-концентрированный 40-% раствор гидроксида натрия;

-стандартное вещество NA₂ CO₃ ;

-раствор индикатора - метилового красного;

-раствор индикатора – бромкрезолового зеленого;

-раствор соляной кислоты;

-приемного раствора (при титровании используется 4%-ный раствор борной кислоты со смешанным индикатором - бромкрезоловый зеленый + метиловый красный.

При подготовке пробы особым условием является ее гомогенность и однородность.

Мясо, колбасы, полуфабрикаты, рыба и другие продукты аналогичной им структуры подвергают 2-кратному измельчению на мясорубке или на гомогенезаторе. Размер частиц образцов не должен превышать 1 мм.

Паштеты и другие пастообразные продукты при подготовке пробы подвергают обработке на гомогенизатлоре, в миксере, в шаровой мельнице или перетиранию в фарфоровой ступке для получения гомогенной структуры.

Жидкие пробы представляют две группы:

1 группа – растворы, содержащие полностью растворенные компоненты (мясной сок, кровь, плазма крови, водные растворы белков и т.д.);

2 группа – суспензии или растворы, содержащие нерастворенные частицы (молоко, сливки и т.д.)

Порядок выполнения работы

1.Подготовить исследуемый образец и отвесить 1 г с точностью до 0,1 мг в пробирку для сжигания.

Отбор образца осуществляется из средней пробы. Для взвешивания образца используются аналитические весы с точностью до ±0, 0001 г. Масса навески гомогенных образцов должна составлять 0,1- 1,0 г. Взвешиваемый образец помещают на безазотную бумажную салфетку. Массу навески определяют следующим образом:

М_н = М_общ. – М_б

Где М_{н –} масса навески, г;

М_общ. – масса навески с бумажной салфеткой, г;

_- М_общ. – масса бумажной салфетки, г.

Жидкие образцы могут быть взяты как по массе, так и по объему.

2.Добавить две таблетки Кьельтаб Сu 3,5 (или 7 г K₂SO₄ + 0,8 г CuSO₄ x 5 H₂O);

3.Перенести взвешенный образец на бумажной салфетке в пробирку для минерализации/сжигания и залить 12 см³ концентрированной серной кислотой и мягко перемешать, чтобы смочить образец кислотой;

4.Присоединить вытяжную систему к пробиркам для сжигания в штативе и установить водяной аспиратор на полный поток;

5.Установить штатив вместе с вытяжкой в предварительно нагретый блок для сжигания;

6.Через 5 минут уменьшить поток в водяном аспираторе до появления паров в головке вытяжной системы;

7.Сжигать образцы до появления голубовато-зеленоватого цвета раствора (примерно, 60 мин по достижении температуры 420⁰ С);

8.Вынуть штатив с пробирками вместе с вытяжной системой и перенести на подставку для охлаждения на 10 – 20 мин.;

9.Осторожно добавить в пробирки по 75 мл дистиллированной воды;

10.Добавить 25 мл приемного раствора в коническую колбу и установить ее в дистилляционный блок, поднять платформу так, чтобы выходная трубка для дистиллята была погружена в приемный раствор;

11.Установить пробирку в дистилляционный блок и закрыть защитную дверцу;

12.Ввести дозатором в пробирку 50 мл 40%-ного раствора NaOH;

13.Открыть паровой клапан на Кьельтеке и вести дистилляцию примерно 5 мин;

14.По истечении примерно 90% времени дистилляции опустить дистилляционную платформу на Кьельтеке;

15.Закрыть паровой клапан по окончании цикла дистилляции;

16.Титровать дистиллят стандартным раствором соляной кислоты

(0,1 Н).Титрование проводят вручную на полуавтоматическом титраторе, предварительно включив электронный блок. Титрование считают законченным, когда раствор в колбе приобретает голубовато-серый цвет. По показаниям на электронном табло отмечают количество кислоты, пошедшей на титрование. На точность результата определения содержания азота/белка существенное влияние оказывает концентрация соляной кислоты, используемой при титровании. Точную концентрацию устанавливают путем титрования раствора соляной кислоты против стандартного раствора карбоната натрия. Для этого в коническую колбу со стандартным раствором карбоната натрия добавляют 10 капель индикатора метилового красного и титруют 0,1 Н раствором НСI до оранжево-розового цвета. Регистрируют объем (V₁). Затем колбу с оттитрованным раствором помещают в водяную баню, нагревают до кипения в течение 2-3 мину, быстро охлаждают проточной водой до комнатной температуры. При этом окраска раствора становится лимонно-желтой. Затем продолжают титрование до получения вновь оранжево-розового цвета, и отмечают объем (V₂ ), пошедший на титрование.

Расчет нормальности раствора проводят по формуле:

Н = 18,868 х m₁

Н

(V₁ + V₂)

где: 18,868 – эквивалентная масса НСI, г;

m₁ – масса стандартного вещества Na₂ CO₃ ,г;

V₁ – объем, пошедший на титрование до кипения, см³ ;

V₂ - объем, пошедший на титрование после кипения, см³

17.Массовую долю белка определить по формуле (в процентах)

N = (V₃ – V₄ ) х Н х 14,007 х 100

М

Где N – содержание азота, %;

V_{3 –} количество кислоты, затраченное на титрование исследуемого

образца, см³ ;

V₄ – количество кислоты, затраченное на титрование холостого

образца, см³ ;

Н – нормальность раствора соляной кислоты;

14, 007 – количество азота, эквивалентное раствору гидроксида

натрия, мг;

М – масса исследуемого образца, мг;

Чтобы определить массовую долю белка необходимо количество азота умножить на коэффициент – фактор пересчета (6,25)

Б = N х F,

Где Б – массовая доля белка, %;

N – количество азота, %;

F – коэффициент, фактор пересчета.

В объемных единицах (мг/см³ ):

N = ( V₃ – V₄) х Н Х 14,007 х 100

V

Где V – объем исследуемого образца, см³ .