Министерство образования и науки РФ

ФГБОУ ВПО «Марийский государственный университет»

Аграрно-технологический институт

Кафедра генетики, разведения и воспроизводства животных

К.С.НОВОСЕЛОВА

ИММУНОГЕНЕТИКА

Методические рекомендации

для студентов 1 курса по направлению подготовки 111100.62 - Зоотехния

Йошкар-Ола, 2011

СОДЕРЖАНИЕ

Введение …..……………………………………………………………………..4

Определение антипенного состава крови сельскохозяйственных

животных …………………………………………………………………………5

Отбор образцов крови ……………………….………………..5

Получение и хранение комплемента……………………….…………………6

Приготовление 2,5 % суспензии эритроцитов……………………………….7

Подготовка сыворотки-реагента к работе……………………………………8

Подготовка комплемента к работе ……………………………8

Маркировка пластин и штативов .……………………….…10

Постановка реакции гемолиза ………………………..…11

Постановка реакции агглютинации ………………………..…12

Постановка непрямой реакции агглютинации (по Кумбсу)………..……...13

Методические указания по выполнению заданий………………………….13

Использование групп крови для контроля достоверности происхождения сельскохозяйственных животных………………………………………………17

Общие принципы установления происхождения…………………………...17

Определение достоверности происхождения крупного

рогатого скота ……………………………18

Определение достоверности происхождения свиней………………………23

Метод иммуногенетического контроля достоверности

происхождения лошадей ……………………………32

Определение генотипа выбывших родителей на основе генотипов оставшихся родителей и потомков……………………………...37

Основные иммуногенетические термины……………………………………..44

Список использованных источников……………..……………………………47

Составитель Новоселова К.С.

Печатается по решению редакционно-издательского совета

Рецензенты: Холодова Л.В., канд. биол. наук, доцент кафедры

генетики, разведения и воспроизводства животных АТИ

Мариского государственного университета

Мартынова Г.П., канд. с- х наук, доцент кафедры

техники прогрессивных технологий АПК

Марийского института переподготовки кадров

агробизнеса

Введение

В настоящее время большое внимание уделяется проблемам зоотехнической иммуногенетики, изучению групп крови, полиморфизма белков и ферментов крови. Группы крови - только один из разделов иммуногенетики. Полиморфизм белков и фермен­тов, определяемых электрофоретически, непосредственно к иммуногенетике не относится, а генетический полиморфизм, изучаемый с помощью иммунологических методов, является областью исследования иммуногенетики.

Иммуногенетический анализ систем крови приобретает важное значение и широкое использование в биологических, зоотехнических и ветеринарных работах в связи с такими про­блемами, как иммунологическая совместимость крови между донором и реципиентом, при пересадке тканей, органов и зигот, иммунная совместимость гамет при оплодотворении. Иммуноге­нетический анализ позволяет установить изменение иммуните­та в процессе онтогенеза, изучить проблему толерантности (отсутствие иммунной реакции на чужой антиген). В практике зоотехнии обостряется потребность в антигенном контроле за правильностью происхождения потомства и определении ис­тинного отца. Это связано в первую очередь с тем, что несмот­ря на то, что племенные книги, точный учет случек, мечение животных гарантируют достоверность происхождения племен­ных животных, могут быть случаи, когда требуется подтвер­ждение происхождения на основе объективных критериев. Это бывает, например, при покрытии маток в одном цикле двумя производителями, при незарегистрированных покрытиях, по­дозрении в умышленной фальсификации, ошибках при мечении и т.д.

Необходимость контролировать происхождение по­томства возникает и в связи с применением искусственного осеменения и работами по трансплантации эмбрионов. При решении этих задач наиболее эффективен метод иммуногенетического анализа. Он основан на определении иммуногенетических маркеров полиморфных систем белков, ферментов и групп крови животного, достоинствами которых является генетическая обусловленность и неизменяемость в онтогенезе.

Группы крови, типы белков и ферментов определяют у жи­вотных в любой возрастной период, начиная с двухнедельного возраста у свиней, с месячного у крупного рогатого скота и овец, с трехмесячного возраста у лошадей.

Изучение генетического полиморфизма групп крови сельскохозяйственных животных дает возможность анализировать генетическую структуру популяции, определять уровень гетерозиготности и характер изменений, происходящих в ней вследствие племенной работы, позволяет совершенствовать разведение по линиям, используя генетические маркеры.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕННОГО СОСТАВА КРОВИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Отбор образцов крови

Образцы крови в количестве 5-10 мл берут у крупного рогатого скота, лошадей, овец из яремной вены, у свиней из малой вены уха или кончика хвоста общепринятыми способами в пронумерованные пробирки, содержащие 3-4 мл антикоагу­лянта ( состав антитикоагулянта для крови разных видов животных приведен в табл.1).

Таблица 1 - Состав антикоагулянтов

Компоненты	Крупный рогатый скот	Свиньи	Овцы	Лошади
Натрий лимонно-кислый трехзамещенный,г	50	32	30	40
Глюкоза, г	10	10	10	20
Альбуцид, г	-	5	5	5
Риванол,г	-	0,04	0,05	0,03
Лимонная кислота,г	-	-	-	10
Стрептомицин ,ед	500000	500000	-	-
Дистилированная вода, мл	до 1000	до 1000	до 1000	до 1000

Содержимое пробирок путем их наклонов в разные стороны очень осторожно перемешивают и закрывают пробкой. На каждую партию крови составляют ведомость . Хранят пробы крови при температуре 4° С. Максимальные сро­ки хранения с момента отбора проб у крупного рогатого скота, лошадей, овец - 10, свиней - 7 дней.

Получение и хранение комплемента

Для приготовления комплемента используют здоровых кроликов массой 1,5 -3 кг, от которых за один прием отбирают до 50 мл крови. Повторные отборы крови производят с интервалами не менее 20дней. Операционное поле протирают ватным тампоном, смоченным спиртом.

Кровь берут в чашки Петри путем поперечного разреза вены ,край уха предварительно протирают ксилолом. Сгусток крови разрезают на сегменты и оставляют на 1 час при комнатной температуре, затем сыворотку сливают в стаканы и центрифугируют при 3500- в течение 7-10 мин. Полученную сыворотку от разных кроликов сливают в один сосуд и проводят абсорбцию комплемента. Для этого 2 части сборной кроличьей сыворотки смешивают с 1 частью отмытых эритроцитов двух-трех особей (крупного рогатого скота, свиней) и центрифугируют при 3500-4000 об/мин в течение 5-6 мин.

Эритроцитами лошади сыворотку кроликов абсорбируют 3 раза. Эритроциты 3-4 лошадей, содержащих антигены А и С ,отмывают физиологическим раствором, смешивают и делят на три равные части. К 40% ( по объему) сыворотки добавляют 60% эритроцитов, смесь выдерживают 15-17 мин при комнатной температуре и центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин.

Эритроцитами овец сыворотку крови кроликов абсорбируют двукратно по 10 мин при температуре 4° С. Соотношение сыворотки и смеси эритроцитов 1:4. Отцентрифугированную сыворотку отсасывают, расфасовывают в капельницы в количестве однократного использования, надписывают дату приготовления комплемента и хранят в морозильных камерах при – 18, - 20° С. В этих условиях активность комплемента сохраняется в течение 3-4 мес.Быстрое снижение активности комплемента происходит при нагревании, хранении при комнатной температуре, воздействии прямых солнечных лучей, повторных замораживания и оттаиваниях.

Комплемент размораживают при комнатной температуре непосредственно перед постановкой гемолитического теста.

Приготовление 2,5 % суспензии эритроцитов

Суспензию эритроцитов каждого животного готовят в от­дельной пронумерованной центрифужной пробирке на 10 мл. В нее вносят 1,5-2 мл крови и добавляют 5-6 кратный объем фи­зиологического раствора. Содержимое пробирок смешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5-6 минут.

Надосадочную жидкость отсасывают водоструйным насо­сом, в пробирку добавляют физиологический раствор, смеши­вают с осадком эритроцитов и снова центрифугируют.

Промывание повторяют 2-3 раза, пока надосадочная жид­кость не станет прозрачной. Из осадка градуированной пипет­кой отбирают 0,25 мл эритроцитов и переносят их в пробирку с 10 мл физиологического раствора и взбалтывают. Концентра­ция NaCl в физиологическом растворе должна составлять: для крупного рогатого скота и овец - 0,9 %, лошадей - 0,92 %, сви­ней - 0,85 %. Суспензию эритроцитов хранят при температуре 4С°. Максимальный срок хранения суспензии эритроцитов крупного рогатого скота и лошадей 2, свиней 1 и овец 3 суток.

Подготовка сыворотки-реагента к работе

Сыворотки размораживают при комнатной температуре или в водяной бане, энергично взбалтывают и разводят до рабочего титра физиологическим раствором, принятым для данного вида животных (табл. 2).

После постановки реакции остаток реагентов замораживают и используют повторно.