Тема 13. Титрование антител к вирусам в реакции торможения (задержки) гемагглютинации (ртга, рзга)

Цель занятия: ознакомление с методикой постановки реакции торможения (задержки) гемагглютинации.

Оборудование и материалы: вирус ньюкаслской болезни с известным титром (от предыдущего занятия), сыворотка крови кролика, иммунизированного вирусом ньюкаслской болезни, обработанная СО₂, физиологический раствор NaCl, 1%-ная суспензия отмытых эритроцитов петуха; плексигласовые панели с лунками, пипетки градуированные на 1 мл, резиновые груши; аппарат Кипа, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Методика проведения занятия и методические указания по теме.

Объяснение преподавателя.

13.1 Принципы серологических реакций. Антителами называются белки, образующиеся в организме теплокровного животного в ответ на парентеральное введение высокомолекулярных веществ с признаками генетической чужеродности для данного организма. Вещества, на введение которых образуются антитела, называются антигенами. Вирусы в подавляющем большинстве являются антигенами. Антитела способны вступать во взаимодействие с тем антигеном, в ответ на который они образовались (специфичность антител), и нейтрализовать его биологическую активность. Таким образом антитела защищают организм от инфекционных агентов, и в этом состоит биологический смысл их образования.

Антитела могут взаимодействовать с гомологичными антигенами не только m vivo, но и in vitro.

Обычно источником антител служит сыворотка крови (serum), и поэтому реакции взаимодействия антител с антигенами in vitro называются серологическими. Одной из простейших серологических реакций является реакция торможения (задержки) гемагглютинации (РТГА, РТЗА). Она основана на том, что антитела при встрече с гомологичным вирусом (антигеном) нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, так как блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс антиген + антитело.

13.2 Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия антител сыворотки и вируса.

Но антитела с антигенами взаимодействуют в строго определенных количественных соотношениях. Поэтому, для того чтобы определенное количество вируса было лишено гемагглютинирующей способности, требуется определенный минимум антител, а так как один из компонентов РТГА всегда неизвестен, приходится реакцию ставить в ряду пробирок с различными дозами антител и одинаковыми дозами вируса или наоборот. Это достигается тем, что берут или разные разведения сыворотки и одно и то же разведение вируса, или разные разведения вируса и одно и то же разведение сыворотки.

РТГА позволяет решать следующие задачи: определять титр антител к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень антигенного родства двух вирусов.

Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток: РТГА возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Принцип титрования антител в РТГА состоит в следующем:

– готовят ряд последовательных (обычно 2-кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (чаще по 0,25 или 0,2 мл);

– к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ;

– смеси выдерживают определенное время при определенной температуре (для вируса ньюкаслской болезни 40–60 мин при комнатной температуре);

– ко всем смесям добавляют равные объемы 1%-ной суспензии отмытых эритроцитов;

– после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах.

В реакции предусматриваются контроли сыворотки, вируса и эритроцитов.

То наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит гемагглютинацию, принимается за показатель титра антител в этой сыворотке.

Задание

Определить в РТГА титр антител к вирусу ньюкаслской болезни в сыворотке крови кролика.

Самостоятельная работа студентов по схеме постановки РТГА: а) получение 2-кратных разведений сыворотки (по 0,2 мл); б) добавление вируса в титре 4 ГАЕ (по 0,2 мл); в) контакт вируса с сывороткой 40–60 мин. в) розлив суспензии эритроцитов; б) экспозиция (30–40 мин); г) Учет и запись результатов титрования антител в РТГА.

Подведение итогов занятия.

Задание к следующему занятию.

Контрольные вопросы:

1. Что такое антигены и антитела?

2. Что такое серологические реакции и для чего они используются?

3. В чем принцип и использование РТГА?

4. Что вы знаете о модификации РТГА?