Тема 15. Использование в вирусологии реакции диффузной преципитации в агаровом геле

Цель занятия: ознакомление с методикой постановки реакции преципитации в агаровом геле

Оборудование и материалы: стекла предметные обезжиренные; пипетки градуированные на 2 или 5 мл; пипетки Пастера; гильзы патрона калибра 5,6 мм; кювета 18x24 см с влажной бумагой или ватой, герметически закрывающаяся (полиэтиленом), или чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой; перья ученические с ручками; 1,2%-ный агар на физрастворе; сыворотка крови кролика, иммунизированного вирусом ньюкаслской болезни; аллантоисная жидкость куриного эмбриона, зараженного вирусом ньюкаслской болезни; сыворотка кролика нормальная; аллантоисная жидкость куриного эмбриона нормального, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Методика проведения занятия и методические указания по теме.

Объяснение преподавателя.

Реакция диффузионной преципитации (РДП) в геле (синонимы: реакция гель-преципитации, реакция двойной диффузии в геле) основана на способности к диффузии в гелях антител и растворимых антигенов и отсутствии такой способности у комплекса антиген + антитело.

15.1 Принцип реакции преципитации. Комплекс антиген + антитело образуется при контакте диффундирующих навстречу друг другу гомологичных антигена и антитела. Он осаждается на месте образования в толще геля в виде полосы преципитации.

Диффузией называется проникновение молекул одного вещества между молекулами другого, обусловленное тепловыми движениями молекул. Диффузия возможна в газах, жидкостях, твердых телах и гелях. Гелями называются такие дисперсные системы, в которых жидкая фаза распределена равномерно среди твердой. Обычно гели образуются высокомолекулярными соединениями, которые дают коллоидные растворы (золи), а при охлаждении превращаются в гели, имеющие некоторые свойства твердых тел. К таким соединениям относятся крахмал, желатин, агар-агар и др. В лабораторной практике очень часто используют агаровый гель.

Антитела сыворотки представляют собой молекулы иммуноглобулинов, которые, несмотря на довольно крупные размеры, способны диффундировать в агаровом геле. Антигены вирусов – это вирусные белки. Они могут находиться в составе вирионов, представляя так называемые корпускулярные антигены, крупные размеры которых не позволяют им диффундировать в агаровом геле. Но белки вирусов могут быть и в виде свободных молекул, образующихся в результате деструкции вирионов и (или) разрушения клеток, в которых они образовались. Это так называемые растворимые антигены. Они способны к диффузии в агаровом геле.

Методика постановки РДП в геле состоит в том, что в слое агарового геля делают несколько углублений (лунок) и в них наливают антигены и сыворотки так, чтобы антиген и сыворотка были в соседних лунках. Из лунок антигены и сыворотки начинают диффундировать в слой геля. Диффузия направлена во все стороны от каждой лунки. В пространстве между лунками, содержащими антиген и сыворотку, последние диффундируют навстречу друг другу (двойная диффузия в геле). Если они окажутся гомологичными, то образуется комплекс антиген + антитело, который к диффузии не способен вследствие более крупных размеров. Он оседает (преципитирует) на месте образования в виде беловатой полосы преципитации, которая хорошо заметна на фоне прозрачного геля (рис. 32). Если же диффундирующие друг другу навстречу антиген и сыворотка будут негомологичны, полосы преципитации не образуется.

Рисунок 32. Схема РДП

Рисунок 33. Схема РДП для идентификации вируса