Тема 5. Использование лабораторных животных в диагностических исследованиях. Биопроба

Цель занятия: ознакомить студентов с методами фиксации и заражения лабораторных животных.

Оборудование и материалы: набор инструментов в стерилизаторе (ножницы, иглы, шприцы, пинцеты, корнцанги), лабораторные животные, суспензии вирусов эктромелии и осповакцины, ватные спиртовые тампоны краски для мечения, эфир, ксилол, мультимедийное оборудование, плакаты и презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Методика проведения занятия и методические указания по теме

Объяснение преподавателя: Для снижения естественной резистентности животных перед заражением их можно облучать рентгеновскими лучами (мышей – 300 Р, морских свинок – 250 – 300, белых крыс – 120, кроликов – 600 Р) или обрабатывать кортизоном (5–10 мг/кг). Все эти приемы ускоряют репродукцию вируса в организме и облегчают его выделение и типирование.

Демонстрация: а) приемов обращения со стерилизованными инструментами, подготовки шприца и его наполнения инфекционным материалом; б) приемов фиксации животных; в) методов экспериментального заражения кроликов и белых мышей.

5.1 Методы экспериментального заражения лабораторных животных. Вируссодержащий материал может быть введен лабораторным животным различными методами. Наиболее часто используются (п/к (в/м), внутрибрюшинное (в/б), внутривенное (в/в), интраназальное (и/н), интрацеребральное (и/ц). Однако в каждом конкретном случае исследователь стоит перед выбором введения материала каким-то одним способом.

Волосы удаляют сульфгидратом кальция, сульфитом стронция или специаль­ным средством по прописи Barium sulforatum – 25,0, Zincum oxydaturn – 12,5, Amylum – 12,5 Депиляторное средство перемешивают с водой до образования кашицы, которую наносят деревянной лопаточкой на нужное место, оставляют на несколько минут и затем тщательно смывают. После этого кожу смазывают вазелином.

Для наркоза мышей, хомяков, хорьков, кроликов и морских свинок исполь­зуют эфир и хлороформ, для крыс и собак – эфир, для кур предпочитают при­менять хлороформ

Выбор метода заражения определяется тропизмом вируса. Под тропизмом вируса понимают способность его репродуцироваться в определенных типах клеток организма. Вирусы, репродуцирующиеся в нервных клетках, называются нейротропными (например, вирус бешенства), репродуцирующиеся в клетках кожи – дермотропными (например, вирус оспы), в клетках легких – пневмотропными (вирус гриппа). Вирусы, способные репродуцироваться в нескольких типах клеток, называются политропными (вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в клетках органов дыхания и размножения), а во всех типах клеток – пантропными (вирус чумы собак).

Зная тропизм вируса, материал вводят в органы, содержащие чувствительные к этому вирусу клетки. Например, вирус гриппа вводят интраназально, вирус оспы – внутрикожно, вирус бешенства – интрацеребрально. Пантропные вирусы лучше разносятся по организму при введении их внутривенно или внутрибрюшинно. Если же исследователь не имеет данных о тропизме находящегося в материале вируса, то заражают животных нескольких групп разными методами.

5.2 Способы фиксации и техника заражения лабораторных животных. Способы фиксации и техника заражения тем или другим методом также различны для животных разных видов. Кроликов удерживают за кожу спины ближе к лопаткам, а другой рукой придерживают за заднюю часть тела. Такая фиксация предотвращает получение царапин. Морских свинок держат одной рукой за грудь, а другой – за задние лапы. Крыс и мышей берут за хвост, дают им возможность уцепиться передними конечностями за металлическую сетку (например, клетки), захватывают двумя пальцами левой руки кожу на затылке и слегка растягивают животное. При этом крыс прочнее и безопаснее фиксировать корнцангами, а для большей надежности голову животного можно удерживать двумя корнцангами за щечные кожные складки. Оба этих корнцанга помощник держит в левой руке, а корнцанг, фиксирующий хвост, – в правой.

Белых мышей без помощника фиксируют, захватывая складку кожи между ушами пинцетом Пеано, который, в свою очередь, укрепляют, набрасывая его кольца на держатели штатива Бунзена или, что еще проще, на стоящую в обычном штативе пробирку. Возможна фиксация мышей и одной рукой.

Перед заражением место введения материала тщательно обрабатывают 3%-ным спиртовым раствором йода.

Смонтировав шприц и укрепив на нем инъекционную иглу, набирают вируссодержащий материал так, чтобы во флакон или пробирку была введена только игла, но не цилиндр шприца.

От попавшего с набираемым в шприц материалом воздуха освобождаются, повернув шприц вертикально вверх иглой, которая предварительно воткнута в толщу стерильного комочка ваты, упакованного в сложенный по типу конверта небольшой лист пергаментной бумаги. Иглу вкалывают в толщу ватика через складки бумаги, где ее не касались руками. Ватики предотвращают потерю капель вируссодержащего материала из шприца, т. е. распространение вируса в окружающей среде. Кроме того, игла, находясь в ватике, до момента инъекции остается стерильной.

Заражение через пищеварительный тракт представляет значительный интерес для выяснения патогенеза болезней, передающихся алиментарным путем (ки­шечные вирусные инфекции).

В зависимости от поставленной задачи животных заражают per os, в желудок и ректально.

Per os – вируссодержащий материал вводят с пищей, а также с помощью тупой иглы, не прикасаясь к слизистым оболочкам, по нескольку капель в один прием. Через несколько минут процедуру повторяют. В желудок инфекционный материал вводят с помощью зонда или желатиновых капсул, содержащих иссле­дуемую суспензию. Ректально заражают путем введения вирусного материала, суспендированного в физиологическом растворе, имеющем температуру тела. при помощи клизмы. Анальное отверстие заклеивают лейкопластырем, создавая копростаз, что ускоряет проникновение в организм заразного начала.

Подкожное заражение. Кожную складку, захваченную большим и указательным пальцами левой руки, приподнимают и в ее основание параллельно поверхности тела вводят иглу со шприцем. Местом инъекции, как правило, у большинства животных является область спины, бока, плеча, лопатки и реже боковой стенки грудной клетки (собака), коленной складки (морская свинка), шеи (куры).

Внутрикожное заражение. Для заражения этим методом у кроликов на боку или животе выстригают, а затем выбривают шерсть на участке кожи. Подготовленное поле протирают спиртом и физраствором. Иглу шприца скосом наружу вводят под острым углом в толщу поверхностного слоя кожи на несколько миллиметров. Материал инъецируют до приподнимания слоя кожи в виде бугорка.

Мелким лабораторным животным внутрикожно вводят материал в плантарную поверхность задней конечности, которую фиксируют, отводя ее назад и помещая на указательный палец левой руки. Правой рукой иглу со шприцем вводят в кожу в направлении от пальцев к голеностопному суставу.

Для размножения в организме дермотропных вирусов (например, возбудителей оспы) содержащий их материал втирают в скарифицированную кожу. На коже, подготовленной как и для внутрикожного заражения, делают несколько поверхностных царапин иглой или обломленной пастеровской пипеткой до появления капелек лимфы. Затем наносят материал и втирают его шпателем, стеклянной палочкой или остриженной зубной щеткой. Заражение в скарифицированную кожу у крупных животных проводят на боку или животе, у морской свинки – на плантарной поверхности ступни, у мелких животных – в области спины, у петухов – в гребень и сережки, а также в перьевые фолликулы голени сразу же после удаления перьев.

Внутримышечное заражение. Для этого способа заражения чаще всего выбирают мышцы бедра, а у кур – большую мышцу груди. Иглу после дезинфекции места инъекции вводят через кожу и подкожную клетчатку в мышцы, направляя перпендикулярно к поверхности тела. После инъекции материала иглу извлекают, место введения повторно дезинфицируют.

Внутрибрюшинное заражение. Животное при данном способе заражения фиксируют вертикально вниз головой для того, чтобы органы брюшной полости сместились к диафрагме и при введении материала игла не травмировала кишечник (рис. 9). В области паха, а у кур на середине расстояния между верхушкой грудной кости и клоаки короткую иглу вводят сквозь кожу и брюшинную стенку, направляя под углом 45° к продольной оси тела. При этом левой рукой слегка оттягивают лапу животного, создавая натяжение кожи и мышц брюшной стенки со стороны инъекции. Проникновение иглы ощущается по исчезнувшему сопротивлению брюшной стенки.

Внутривенное заражение. Важно контролировать, чтобы в вену из шприца не попали пузырьки воздуха или частицы материала, которые могут вызвать эмболию и гибель животного.

Рисунок 9 Внутрибрюшинное заражение мыши

Рисунок 10. Внутривенное заражение мыши

Белых мышей и крыс заражают в боковые вены хвоста, предварительно расширив их, растирая тампоном, смоченным ксилолом или горячей водой. Помощник левой рукой сдавливает хвост у корня, а правой фиксирует животное за кожу затылка (рис.10). Иглу скосом наружу вводят под острым углом в вену нижней трети хвоста, где кожа тоньше, и направляют к корню хвоста. Если игла попала в сосуд, то жидкость легко поступает из шприца, а сосуд на всем протяжении бледнеет.

Освободив вену у корня хвоста, медленно вводят материал. Затем вену передавливают ниже места вкола, иглу извлекают и место инъекции прижимают сухой ватой.

Морским свинкам можно ввести вирус в ток крови, только проникнув иглой в сердце. Для этого определяют место сердечного толчка, в межреберный промежуток слева и на 1 см выше мечевидного отростка вводят иглу без шприца. Если в игле покажется кровь, значит, игла попала в сердце, и тогда, присоединив шприц, инъецируют материал.

Кроликам внутривенно материал вводят в краевую вену уха, предварительно удалив волосы на месте инъекции и пережав сосуд ниже вкола иглы. Игла должна быть направлена по ходу тока крови, т.е. к голове.

Птице вируссодержащий материал вводят в подкрыльцовую вену.

Интраназальное заражение. Большинство лабораторных животных (за исключением кроликов) при закапывании материала в ноздри чихают и разбрызгивают вируссодержащую суспензию. Поэтому перед интраназальным заражением животным делают глубокий эфирный наркоз. Для этого помещают их в банку с крышкой и кусочком смоченной эфиром ваты. Заснувших животных извлекают, фиксируют вверх ноздрями. Материал по каплям вводят в ноздри, и с вдыхаемым воздухом он втягивается внутрь.

Кроликам же вируссодержащую суспензию можно закапывать в ноздри по каплям при запрокинутой на спину голове без наркоза.

Рисунок 11. Интрацеребральное заражение кролика

Интрацеребральное заражение. Кожу головы мышат большим и указательным пальцами левой руки оттягивают к затылку. Иглой шприца с ограничителем прокалывают кожу и череп на глубину 1–2 мм в точке, лежащей в центре квадрата, образованного средней сагиттальной линией и перпендикуляром к ней, проходящим по наружному краю глазниц.

Белых крыс интрацеребрально заражают через трепанационное отверстие, а молодых кроликов и морских свинок – прокалывая кости черепа в надглазничной борозде, где кость довольно тонкая. Иглу используют с ограничителем, обеспечивающим проникновение иглы не более чем на 4–5 мм. Старых животных интрацеребрально заражают через трепанационное отверстие (рис. 11).

Объем заражающей дозы материала значительно варьирует в зависимости от метода внесения и вида животных (табл. 4).

Таблица 4

Максимальные объемы вводимого материала для лабораторных

Метод заражения	Кролики	Морские свинки	Белые крысы	Белые мыши
Внутрикожный	0,1	0,1	0,05	0,02
Подкожный	5,0	3,0	3,0	0,5
Внутримышечный	5,0	2,0	1,0	0,3
Внутрибрюшинный	10,0	5,0	2,0	1,0
Внутривенный	5,0	2,0	2,0	1,0
Интраназанальный	1,0	0,3	0,1	0,03
Интрацеребральный	0,3	0,05	0,03	0,02

5.3 Содержание лабораторных животных после заражения. После заражения животные должны быть помещены в клетки, на которые навешивают этикетки с указанием вируса или номера экспертизы исследуемого материала, количества и номеров зараженных животных, даты заражения. В рабочем журнале записывают название вируса или номер экспертизы исследуемого материала, количество и характеристику зараженных животных, их маркировку, метод введения и дозу вируса.

За животными устанавливают наблюдение, обращая внимание на их внешний вид, подвижность, прием корма и т. п. Следует отметить, что гибель животных в первые дни после заражения может быть связана с травмой или токсическим действием исследуемого материала.

Задания

1. Отработка приемов фиксации и экспериментального заражения лабораторных животных всеми методами.

2. Заражение внутрикожно белых мышей вирусом эктромелии и кроликов вирусом осповакцины.

Самостоятельная работа студентов

Студенты отрабатывают приемы фиксации и экспериментального заражения лабораторных животных всеми методами.

Подведение итогов занятия

Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы:

1. С какой целью используют лабораторных животных в вирусологических исследованиях.

2. Требования, предъявляемые к лабораторным животным, уход, содержание.

3. Животные - гнотобиоты. СПФ - животные .

4. Методы заражения лабораторных животных.