15.2 Основные задачи рдп:

– обнаружение в сыворотке крови S антител, гомологичных данному антигену AS (например, вирусу), производится при помощи схемы РДП, показанной на рисунке 52. Если в сыворотке S содержатся антитела к антигену AS, между лунками S и AS образуется полоса преципитации, отсутствующая между лунками с контрольными компонентами SN и AS;

– обнаружение в материале антигена AS, гомологичного известным антителам сыворотки SS, производится по аналогичной схеме РДП (рис. 53). При наличии в исследуемом материале антигена, гомологичного антителам сыворотки SS, между А и SS должна образоваться полоса преципитации, отсутствующая между остальными лунками;

– идентификация неизвестного вируса может быть произведена в РДП по схеме, показанной на рисунке 33. Здесь AS – неизвестный антиген; SS .SS₆ – сыворотки, содержащие антитела к известным антигенам. Если полоса преципитации образовалась, например, между лунками с AS и SS₃, значит, исследуемый антиген гомологичен антителам сыворотки SS₃;

– титрование антител сыворотки. Здесь высшее разведение сыворотки, еще дающее преципитацию с гомологичным антигеном (в нашем примере 1 : 16), служит показателем титра антител в сыворотке SS.

РДП может быть поставлена в чашках Петри, на предметных стеклах и в капиллярах. Наиболее широкое применение в практике нашел метод постановки РДП на предметных стеклах. Для его осуществления необходимо иметь обезжиренные предметные стекла, градуированные пипетки на 2–5 мл и пастеровские пипетки; трубку диаметром около 5 мм с острыми краями или специальный штамп, влажную камеру, ученическое перо или другой инструмент, пригодный для извлечения агарового геля из лунки, 1,0–-1,5%-ный агар на физрастворе или фосфатном буфере с рН 7,2–7,4, антигены, сыворотки.

Специфические антигены и сыворотки должны быть в высоких титрах, обеспечивающих образование комплекса антиген + антитело в количестве, достаточном для образования четко видимой полосы преципитации.

15.3 Постановка РДП. Техника постановки состоит в следующем. Обезжиренные предметные стекла укладывают горизонтально на холодную поверхность (можно на стол). Пипеткой набирают 1,5– 2 мл агара, нагретого до 60 °С, и зигзагообразным движением выливают его сначала по периметру предметного стекла, а потом быстро заполняют его середину, следя за тем, чтобы не образовывались пузыри и волны. Стекла с налитым агаром, слой которого должен быть 1,5–2 мм, оставляют лежать 5–10 мин для'затвердения агара (превращения золя в гель). В слое застывшего агара вырезают лунки. Их количество и взаимное расположение определяются целью, с которой ставят РДП, но диаметр лунок должен быть около 5 мм, а расстояние между соседними лунками – 3–4 мм. Наиболее часто используют два типа расположения лунок.

Для вырезания лунок можно использовать готовый штамп, представляющий собой трубочки с острыми краями, жестко скрепленные в соответствии с типом расположения и количеством лунок. Если готового штампа нет, можно воспользоваться любой трубкой подходящего диаметра, например гильзой от патрона к мелкокалиберной (калибр 5,6) винтовке. В этом случае целесообразно нарисовать карандашом на бумаге количество и взаимное расположение лунок и, подложив этот трафарет под стекло с агаром, по нему вырезать лунки. Остающийся в лунках агар можно извлечь иглой, ученическим пером или пастеровской пипеткой. У образовавшихся лунок дном служит стекло, а стенками – слой агара. Чтобы избежать подтекания жидкостей под агар, рекомендуют лунки заплавить, с тем чтобы они были полностью в слое агара. Для этого можно воспользоваться разными приемами. Один из них состоит в том, что пастеровской пипеткой в лунку вносят горячий (50–60 °С) агар и тотчас отсасывают его обратно. Соприкасаясь на короткое время с холодным дном и стенками лунки, агар успевает частично застыть и покрыть тонким слоем дно и стенки лунки. Схематически это выглядит так, как показано на рисунке 34. Однако если стекла хорошо обезжирены и застывший слой агара прочно сцеплен со стеклом (не «плывет» при наклоне), то и без дополнительной заливки лунок полосы преципитации образуются нормально.

В подготовленные лунки заливают компоненты РДП (антигены и сыворотки). Нужно следить, чтобы компоненты ни в коем случае не переливались через край лунок, а только заполняли объем каждой. Для этого их лучше заливать мелкими каплями с помощью тонко оттянутых пастеровских пипеток.

Рисунок 34. Схема зливки агара

После заливки компонентов РДП предметные стекла помещают во влажную камеру, чтобы предотвратить высыхание агара. В качестве влажной камеры можно использовать любую закрывающуюся емкость (эксикатор, чашку Петри и т. п.), в которую положены намоченные водой вата или фильтровальная бумага. Влажную камеру оставляют при комнатной температуре или ставят в термостат (в термостате диффузия идет быстрее, но незначительно).

Предварительный учет результатов РДП производят через 8–10 ч, основной – через 24 и окончательный – через 48 ч.

Постановка РДП в чашках Петри по технике принципиально не отличается от постановки на предметных стеклах, только тогда слой агара наливают толщиной до 3 мм, лунки делают большего диаметра и на большем расстоянии. Но в этом случае время учета отодвигается до 5–7 дней.

Методика РДП в капиллярах не нашла широкого применения в практике, и на ней мы останавливаться не будем.

Препараты РДП на предметных стеклах можно через. 48–72 ч высушить и окрасить раствором амидного черного. Это позволяет сохранять препарат неопределенно долго и улучшает возможности фотографировать полосы преципитации.

Достоинства РДП следующие: простота техники постановки, быстрота получения ответа, нетребовательность к чистоте компонентов, не требуется стерильной работы, минимальная потребность в компонентах, пригодность для работы с любыми растворимыми антигенами, возможность документирования результата путем фотографирования.

Но все эти достоинства существенно умаляются ее основным недостатком – низкой чувствительностью. Тем не менее РДП достаточно широко пользуются в лабораторной диагностике вирусных болезней животных.

Задание

Определить наличие в сыворотке крови кролика антител к вирусу ньюкаслской болезни.

Самостоятельная работа: а) залив агара на предметные стекла; б) изготовление лунок в слое агара; в) разлив компонентов РДП; г) снаряжение влажной камеры; д) зарисовка схемы РДП в тетрадях; е) учет результатов РДП и их внесение в схему РДП производятся на следующий день или на следующем занятии.

Подведение итогов занятия.

Задание к следующему занятию.

Контрольные вопросы

1. В чем принцип РДП?

2. Какие задачи позволяет решать РДП?

3. В чем достоинства и недостатки РДП?