8. Методы генетической трансфекции в генной терапии

Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена (его экспрессии).

Трансфекция может проводиться с использованием чистой ("голой"-naked) ДНК, легированной (встроенной) в соответствующую плазмиду, или комплексированной ДНК. Комплексированная – плазмидная ДНК, соединённая с солями, белками (трансферрин), органическими полимерами, или ДНК в составе вирусных частиц, предварительно лишённых способности к репликации.

Обнажённая ДНК при внутримышечном введении способна экспрессироваться в количествах, достаточных для развития иммунного ответа на появление новых белков. Этот эффект потенциально может быть использован в целях вакцинации против определённых патогенных вирусов, однако не достаточен для большинства терапевтических целей.

Для доставки генетического материала идеальной представляется "молекулярная машина", обладающая такими качествами как:

1. Высокая степень безопасности и надёжности в сочетании с достаточной дешевизной и возможностью широкого применения;

2. Способность сохранять активность при движении в русле крови в течение длительного и контролируемого времени, и при этом не распознаваться иммунной системой, не вызывать воспалительных процессов;

3. Высокая избирательность взаимодействия только с клетками-мишенями;

4. Достаточный объём генетической информации и высокая эффективность, при которой достигается экспрессия каждой доставляемой молекулы ДНК;

5. Возможность трансформировать заданное количество клеток от нескольких процентов до заведомо гарантированной 100%-й трансформации, что особенно важно при лечении онкологических заболеваний и некоторых вирусных инфекций;

6. Возможность контролировать как интенсивность, так и время экспрессии на основе данных клинического наблюдения.

Основные методы доставки чужеродных генов в клетки разделяются на физические, химические и биологические.

ФИЗИЧЕСКИЕ: микроинъекция, инъекция струёй, электропорация, замораживание-оттаивание, биобаллистика (бомбардирование клеток каплями жидкости или суспензией частичек золота с адсорбированной плазмидой).

ХИМИЧЕСКИЕ: соли некоторых катионов, например, кальция, ДЕАЕ декстран, полилизин, липосомы.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ: вирусные векторы.

Таблица 3.

Основные характеристики генетической трансфекции in vitro

Метод	Трансдукция	Интеграция	Экспрессия
Химические
Ca – фосфат преципитация	Низкая	Низкая	Транзиторная
Физические
Электропарация	Низкая	Низкая	Транзиторная
Микроинъекция	Высокая	Низкая	Транзиторная
Слияние
Липосомы	Низкая	Низкая	Транзиторная
Рекомбинантные вирусы
Аденовирус	Высокая	Низкая	Транзиторная
Вирус Герписа	Низкая	Низкая	Слабая
ВИЧ	Высокая	Высокая	Длительная

Обзор данных (табл. 3.) позволяет прийти к заключению, что несмотря на усилия многих лабораторий мира все усилия известные и испытанные in vitro и in vivo векторные системы далеки от совершенства. Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных in vitro успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие характеристики существующих векторных систем – стабильности интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность – все еще нуждается в серьезных доработках. [1]

Повысить эффективность стабильной интеграции можно:

1. Путём совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем;

2. Путём создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть ДНК-структур, способных к длительной персистенции внутри ядер).

В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих. Благодаря наличию основных структурных элементов такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время.

Теперь остановимся подробнее на некоторых методах.