12. Моральные проблемы генной терапии

Пока в области генной терапии многое неясно, трудно предусмотреть все последствия переноса генетического материала в человеческий организм, а также оценить его терапевтическую эффективность. Поэтому существует международный запрет на проведение испытаний на половых клетках и клетках ранних доимплантационных зародышей человека, чтобы предотвратить передачу неблагоприятных генетических изменений потомкам, не допустить засорения генофонда нежелательными искусственными генными конструкциями или внесения мутаций с непредсказуемыми последствиями для будущего человечества.

Ф. Андерсон и Дж. Флетчер сформулировали три условия, которые сегодня общепризнанны. Для разрешения клинических испытаний в области генной терапии необходимо доказать в экспериментах на животных, что:

1. Нужный ген может быть перенесён в соответствующие клетки-мишени, где он будет функционально активен достаточно продолжительное время.

2. Будучи перенесённым в новую для себя среду, этот ген не потеряет свою экспрессию, то есть сохранит эффективность.

3. Такой перенос не вызовет неблагоприятных последствий в организме.

Вместе с тем в научной литературе всё чаще и настойчивее раздаются призывы к возобновлению дискуссии о целесообразности генокоррекции зародышевых и половых клеток человека.

Вот некоторые вопросы, которые должны быть решены в рамках предлагаемой генетиками широкой дискуссии по генной терапии.

1. Сможет ли в будущем генная терапия обеспечить столь полноценную генокоррекцию, которая не представит угрозы для потомства?

2. В какой мере полезность и необходимость генотерапевтической процедуры для одной супружеской четы перевесят риск такого вмешательства для всего человечества?

3. Сколь оправданы будут эти процедуры на фоне грядущего перенаселения планеты?

4. Как будут соотноситься генноинженерные мероприятия на человеке с проблемами гомеостаза общества и биосферы?

Таким образом, генетическая революция, апофеозом которой явилась генотерапия, не только предлагает реальные пути лечения тяжёлых наследственных и ненаследстевнных недугов, но и в своём стремительном развитии ставит перед обществом новые проблемы, решение которых настоятельно необходимо уже в ближайшем будущем.

Заключение

Появление принципиально новых технологий, позволяющих активно манипулировать с генами и их фрагментами, обеспечивающими адрес­ную доставку новых блоков генетической информации в заданные уча­стки генома, совершило революцию в биологии и медицине. Сам ген все чаще начинает выступать в качестве лекарства, применяемого для лечения не только моногенных, но и мно­гих других, в том числе и значительно более распространенных недугов (опухолей, инфекций). Не за горами применение генотерапии и для борьбы с мультифакториальными заболеваниями (сердечно-сосудисты­ми, психическими, эндокринологическими и многими другими).

Обзор существующих данных позволяет прийти к заключению, что несмотря на усилия многих лабораторий мира все уже известные и испытанные in vivo и in vitro векторные системы далеки от совершенства. Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а доставка последней в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается путем создания комбинированных рецептор-опосредованных конструкций. Всё еще нуждаются в серьезных доработках характеристики существующих векторных систем - стабильность инте­грации, регулируемая экспрессия, безопасность. Стабильности экспрес­сии можно достич либо при интеграции чужерод­ной ДНК непосредственно в геном реципиента, либо путем обеспечения длительной персистенции экзогенной ДНК в ядре. Интеграция в геном достигалась только при использовании ретро-вирусных либо аденоассоциированных векторов. Повысить эффективность стабильной интеграции можно путем совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем. Но при этом эти векторные конструкции должны включать только часть вирусных генов, например, гены обратной транскриптазы, ретровирусной интегразы, некоторые транспозоновые гены, парвови-русные rep-гены. Учитывая возможный мутагенный эффект случайной интеграции, весьма перспективным представляется создание достаточно стабильных эписомных векторов. Привлекательной в плане генной коррекции представля­ется возможность замены всего мутантного гена или его мутировав­шей части на нормальный аналог, что мо­жет быть достигнуто путем гомологичной рекомбинации. При этом в идеале можно ожидать не только длительную персистенцию введенно­го гена, но и сохранение нормальной экспрессии. С этой целью в кон­струкции, используемые для переноса ДНК, включают агенты, повы­шающие частоту гомологичного спаривания, например, бактериаль­ную рекомбиназу. В таких условиях частота гомологич­ной рекомбинации может превышать 2,5x10¹¹. Этого достаточно для того, чтобы с помощью ПЦР отобрать нужные клоны клеток.

Весь накопленный огромный материал и созданные и создаваемые принципиально новые технологии все чаще будут приводить, сначала небольшим, а потом и серьезным успехам в лечении все увеличивающегося числа заболеваний человека. В конце концов генная терапия войдет в разряд важных, а может быть, и важнейших подходов практической медицины.

ПРИЛОЖЕНИЯ:

Рис. 1. Схема генной терапии ex vivo.

Рис. 2. Принцип конструкции ускорителя микрочастиц (генной пушки)

А - дробовое ружье: 1 - пороховой заряд, 2 - войлочный пыж, 3 - дробь;

Б - пороховой ускоритель Клейна и Стэнфорда: 1 - пороховой заряд, 2 - макроноситель (аналог пыжа), 3 - микрочастицы вольфрама, несущие вводимую ДНК, 4 - стопорная диафрагма для остановки микрочастиц:

В - ускоритель Колесникова: 1 - заряд гремучей ртути, 2 - макроноситель, 3 - смесь микрочастиц золота и вольфрама, покрытых вводимой ДНК, 4 - стопорная диафрагма для остановки микрочастиц, 5, 6 - сетчатые диафрагмы для удаления частей разрушенного макроносителя и дезинтеграции конгломерата микрочастиц соответственно.

рис. 3. ДНК – поликатион.

Рис.5.

"Идеальная" конструкция липосомы для направленной доставки лекарственного вещества в клетку; 1) Полимер для стерической защиты от клеток РЭС- Ретикуло-эндотелиальной системы ( например ПЭГ- полиэтиленгликолем); 2) "Молекулярный адрес" на полимерной ножке (в основном иммуноглобулины); 3) Белки слияния (например, гемагглютинин); 4) Лекарственное вещество (например, ДНК); 5) Липидные положительно заряженные частицы для компактизации ДНК; 6) Мембранообразующие липиды (фосфатидилхолин); 7) Липиды, дестабилизирующие мембрану (например, ФЭ-фосфатидилэтаноламин).

Рис. 6. Схема генома простого ретровируса (Mo-MuLV) и его генетические элементы с цис- и транс- функциями.

Элементы с цис-функциями - гены, кодирующие следующие белки:gag - MA (матриксный p15), р12, CA (капсидный p30), NC (белок нуклеокапсида p30) pol - PR (протеаза), RT (обратная транскриптаза/РНКаза Н), IN (интеграза) env - SU (поверхностный gp70), TM - трансмембранный белок.

Элементы с цис-функциями: Y-последовательность - сигнал упаковки/димеризации вирусной РНК аtt - последовательности, по которым идет интеграция в геном E, P - энхансер/промотор PBS - primer binding site - участок связывания специфической тРНК pA - сигнал полиаденилирования PP - полипуриновая последовательность SA, SD - акцепторный и донорный сайты сплайсинга.

Рис. 7. Cхематическое изображение ретровирусных векторов (в виде ДНК-провирусов) 1, 2 - использование разных промоторов для экспрессии двух генов; 3 - использование для экспрессии двух генов типичной для ретровирусов системы сплайсинга; 4 - использование IRES (internal ribosome entry site) последовательности, которая обеспечивает трансляцию полицистронных мРНК; 5 - вектор, кодирующий "fusion"-белок, нужен только один промотор Y- пси-область, ВП - внутренний промотор, SD,SA - донорный и акцепторный сайты сплайсинга, Стрелками показано направление транскрипции.

Рис. 8. Схематическое изображение структурно-функциональных изменений ретровирусного вектора, приводящих к делециям в промоторно-энхансерных областях обоих LTR а) - ретровирусный вектор (оба LTR содержат энхансерно-промоторную область) б) - самоинактивирующийся вектор в виде провируса в геноме упаковывающей клетки в) - самоинактивирующийся вектор в виде провируса, интегрированного в геном клетки-мишени трехугольник - делеция промоторно-энхансерной области; стрелка - направление транскрипции, задаваемой активным промотором; Р - внутренний промотор, Х - клонированные ген/гены .

Рис. 10. Схема переноса генов с использованием ретровирусных векторов

Этапы переноса:

1. Клонирование гена (генов) в ДНК ретровирусного вектора

2. Трансфекция ДНК вектора с клонированным геном в упаковывающие клетки

3. Сбор культуральной среды упаковывающих клеток

4. Трансдукция гена в составе вектора в клетки-мишени

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Баранов В.С. Генная терапия – медицина XXI века // Соросовский образовательный журнал. – 1999. – № 3. – С. 63–68. (Санкт-Петербургский государственный университет)

2. Баранов В.С. "Генная терапия-медицина XXI века"; Ж. "Соросовский образовательный журнал", 1999. - №3. - С. 63.

3. Баранов В.С. Ж. "Природа", 1996. №8. - С. 25.

4. Бердышев Г.Д. Биологическая инженерия и старение, 1988. - Киев, "Выща шокла".

5. Вестник АМН СССР, 1990. - №8. – С. 35-37.

6. Ж. "Природа", 1991. - №2. - С. 109.

7. Тараховский Ю.С., Иваницкий Г.Р. "Липосомы в генной терапии. Структурный полиморфизм липидов и эффективность доставки генетической информации"; Ж. "Биохимия", 1998. - т.63, вып.1,№6.

8. Тищенко П.Д. "Ген-этика"; Ж. "Человек", 1996 год, №6. - С.67.

9. Шмек Х. "Генная терапия – новая надежда медицины"; Новая еженедельная газета, 1994. - приложение "Эврика"№7, 18 мая.

10. [1] http://www.textreferat.com/referat-3874-9.html

11. http://afonin-59-bio.narod.ru

12. http://afonin-59-salix.narod.ru