7.9.4. Мешающие влияния

Мешающие влияния — обобщенное название любого фактора, который вызывает смещение результата анализа. Большинство из наблюдаемых эффектов классифицированы как влияние основы, но это не устанавливает действительную природу проблемы. Может быть несколько источников ошибок, каждый из которых может проявляться различным образом.

Рис. 7.9-19. Ферментный иммунный анализ с усиленной люминесценцией в конечной точке.

Рис. 7.9-20. Включение ферментной метки в биолюминесцентный процесс.

Схема 7.9-5. АТФ в цикле генерации света люциферазой светляков.

Таблица 7.9-6. Примеры хемилюминесцентных усилителей в реакции окисления люминола, катализируемой пероксидазой хрена

Производные фенола и нафтола 1 и-Иодфенол 2,4-Дихлорфенол 6-Гндроксибензотиазол л-Гидроксикоричная кислота 2-Циано-6-гидрокси- 1,6-Дибром-2-нафтол л-Фенилфенол бензотиазол 2-Хлор-4-фенилфенол Производные ароматических аминов 4-Бензоксианилин „т _ N-Тетраметилбензидин 3-Аминофлуорантрен

9. Эффективная концентрация определяемого вещества

Следует позаботиться об обеспечении оптимальных условий анализа с целью уменьшения ошибок.

В иммунном анализе определяемое вещество должно участвовать в равновесии связывания с распознающей молекулой. Если это связывание нарушено или если определяемое вещество вовлечено в связывание с другими молекулами, эффективная концентрация определяемого вещества оказывается заниженной. Во многих случаях определяемое вещество в пробе существует как в свободной, так и в комплексной формах; например, многие гормоны могут быть в равновесии с комплексом гормон-глобулин или гидрофобные стероиды могут быть распределены в липидных полостях. В первом случае эффект обычно преодолевают, добавляя блокирующий агент, тогда как липидный захват разрушают присоединением селективных поверхностно-активных веществ.

Однако, если не позаботиться о том, чтобы все определяемое вещество в пробе было в свободном виде, тогда предварительная обработка (или хранение) пробы может существенно влиять на результат. Тироксин (Т4) и многие другие малые молекулы почти полностью связаны с белком, но вытесняются с помощью неэтерифицированных жирных кислот. Поскольку эти жирные кислоты образуются при хранении пробы из-за воздействия липаз, то определение тироксина может стать скорее способом оценки возраста пробы, чем уровня определяемого вещества.

Комплексообразование может также включать ионы, а не белки или липиды, но в этом случае отсутствие комплекса может быть источником проблем, поскольку многие белковые определяемые вещества содержат центры связывания двухвалентных катионов, и антитела, выращенные на эти белки in vivo, могут распознавать конфигурацию, удерживаемую катионным комплексом (главным образом, Са2+ или Mg2+); таким образом, в отсутствие этих катионов конформация может измениться, так что распознавание с антителом становится неэффективным и анализ терпит неудачу.