4. Метки Радиоактивные метки

Наиболее широко в качестве радиоактивных меток для иммунного анализа используют ¹²⁵1 и ³Н.

Обычно в качестве метки выбирают ¹²⁵1, 7-излучатель, или ³Н (тритий), /^-излучатель, хотя используют также ⁵⁷Со (для витамина B_i2) и ¹⁴С. Тритий дает меньшую чувствительность, чем ¹²⁵1, поскольку испускаемые /3-частицы слабы (Е_тах = 18,6кэВ; Е_ср = 5,5кэВ) и легко поглощаются стенками сосуда. 7-Лучи, испускаемые ¹²⁵I (E =28-35 кэВ), не поглощаются сосудом, а эффективность счета при использовании сцинтилляционного счетчика обычно составляет около 80%.

В некоторых случаях метку можно присоединить путем простого изотопного замещения; в большинстве потенциальных определяемых веществ водород можно заместить на тритий, но природные определяемые вещества, содержащие иод (например, тироксин Т₄), встречаются значительно реже. Следовательно, чтобы использовать в качестве метки ¹²⁵1, обычно бывает необходимо присоединить его как «ярлык».

Белки

Простейший способ маркирования белков заключается в прямом замещении в ароматическом кольце тирозина или гистидина. Однако распад радиоактивного нуклида передает молекуле энергию, которая превышает энергию химических связей, и, следовательно, существует опасность разрыва соседних связей и нарушения молекулярной структуры. Таким образом, хотя высокий уровень замещения дает более высокую чувствительность, практически уровень замещения составляет порядка одного атома 1251 на молекулу белка, поскольку более высокий уровень замещения приводит к радиолизу, дезактивирующему белок.

Схема 7.9-1. Методы маркирования изотопом 12SI. a — внедрение иода с помощью хлорамина-Т в качестве окислителя; б — внедрение иода с лактопероксида-зой (LPO) и пероксидом водорода в качестве окислителя; е —синтез конъюгата метилового эфира тирозина: Ce-кетогруппа 6-кето-17/3-эстрадиола; г —конъюгаци-онное маркирование, при котором К-гидроксисукцинимидил-3-(4-гидрокси-5-{125!}-иодфенил)пропионат реагирует со свободными аминогруппами.

Предложен ряд методов такого иодирования, но основные успехи в радиоиммунном анализе (РИА) получены Гинвудом и Хантером (1961; схема 7.9-1,а) при разработке метода окисления хлорамином-Т. Однако этот неспецифический окислитель подходит не для любого приложения, и растущую популярность получил ферментативный метод, использующий лактопероксидазу и пероксид водорода (Марчелонис, 1969; схема 7.9-1,5).

5. Гаптены и полипептиды

Маркирование пептидов и белков обычно затрагивает ароматическое кольцо тирозина или гистидина.

Когда пептид или гаптен не содержит ароматического кольца, способного к замещению иодом (например, тирозина), обычным подходом является получение конъюгата с меченой молекулой. Очевидным выбором такой маркирующей системы является тирозиноподобный остаток, и производными, используемыми для этой цели, могут быть метиловый эфир тирозина, тирамин или гиста-мин и т. д. (схема 7.9-1,в). Однако доступнее другие иодированные соединения, например, N-гидроксисукцинимидный эфир 3-(п-гидроксифенил)пропионовой кислоты; схема 7.9-1,г; прямая реакция этого реагента со свободными аминогруппами приводит к присоединению через амидную связь. В целом, выбор реагента для присоединения зависит от наличия реакционных групп в пептиде или гаптене (табл. 7.9-2).