6. Частицы, рассеивающие свет, в качестве меток

Рассеяние света на частицах дает информацию о размерах частицы или агрегата, которую можно использовать для проведения иммунного анализа.

Концепция агглютинации известна с 1920-х гг. в микробиологическом анализе. Этот принцип можно положить в основу образования комплекса между антителом и антигеном, где имеется поливалентное связывание. Поливалентный белок будет реагировать со своим антителом, образуя осаждающийся комплекс, но реакция в высокой степени зависит от таких факторов, как ионная сила и ионные частицы, и осложняется изменением реакционной способности различных антигенных связывающих центров на антителе. В принципе, по мере протекания реакции образование комплекса может приводить к изменению способности среды рассеивать свет, но в идеале комплекс должен оставаться во взвешенном состоянии.

Более удобным способом является использование частиц-меток для усиления светорассеивающих свойств меченого конъюгата. Когда частицу облучают монохроматическим светом, падающее поле вызывает флуктуацию диполя и свет рассеивается перпендикулярно оси диполя в направлениях, которые дают информацию о размере частицы. Характер рассеяния зависит от соотношения между объемом частицы и длиной волны. Если длина волны намного больше, чем частица, свет одинаково рассеивается во всех направлениях, но если размер частицы увеличивается, то интерференция рассеянного света в различных точках на частице уменьшает количество света, рассеиваемого обратно в сторону источника, и образует участки высокой интенсивности (рис. 7.9-9).

При измерениях, когда частицы находятся в броуновском движении, интенсивность света, собранного под фиксированным углом, флуктуирует в соответствии с этим движением, потому что она зависит от времени, которое нужно частице для диффузии на расстояние, сравнимое с длиной волны. Рассеянный под фиксированным углом свет имеет фазовый сдвиг и вектор рассеяния К определяется выражением

Рис. 7.9-9. Рассеяние света в направлении, перпендикулярном оси диполя, как функция объема частицы V.

где п — показатель преломления фазы суспензии, а 9 — угол рассеяния. Интенсивность детектируемого света флуктуирует в масштабе времени, сравнимом с временем, за которое частица диффундирует на расстояние, достаточное для гого, чтобы вызвать фазовый сдвиг на тг, причем это время обратно пропорционально К.

Наиболее распространенным металлическим «ярлыком» в этом методе является золото благодаря его высокому показателю преломления и относительной простоте приготовления. Можно получить частицы одинакового размера в диапазоне от 5 до 60 нм. Однако латексные частицы также просты в получении, а кроме того, они обеспечивают большую гибкость при управлении их свойствами. Наилучшие характеристики получены при узком распределении размеров, так что суспензия в течение анализа поддерживается без излишнего перемешивания. Синтез проводят обычно одним из трех основных способов:

- полимеризация суспензии,

• полимеризация эмульсии,

• полимеризация набухшей эмульсии.

Процессы включают образование мицеллы поверхностно-активного вещества, которая принимает мономер и инициатор полимеризации. Средний размер частиц полученного полимера управляется концентрацией реагента, температурой и скоростью перемешивания. Мономеры с боковыми реакционными группами (например, акриловая кислота, -СООН; глицидилметилакрилат, эпоксигруппа; акриламид, -NH2) допускают последующее присоединение к антигену или антителу. Присоединение антитела к частицам показывает, что имеется оптимальная загрузка, и вне ее пределов стерические затруднения или обеднение поверхности антигеном (см. обсуждение методов поверхностной иммобилизации в разд. 7.8.2) снижает эффективность связывания. Сходные проблемы возникают также при присоединении к частицам антигена.

Эффекты неспецифического связывания могут также быть источником проблем. Изменение поверхности частиц влияет на агрегацию частиц и адсорбцию реагента, так что следует оптимизировать условия, чтобы уменьшить вандерваальсово притяжение между частицами, обеспечив достаточное куло-новское отталкивание, но не ингибируя реакцию антитело—антиген.