2. Сандвичевый анализ

В Сандвичевом иммунном анализе определяемое вещество из пробы захватывается избытком антител, а количество захваченного определяемого вещества оценивают с помощью второго антитела, образующего, таким образом, сандвич.

Как упомянуто ранее, место распознавания на антигене представляет собой небольшую зону, поэтому может быть несколько различных эпитопов, которые пространственно разделены на антигене. Эту особенность можно использовать в «Сандвичевом» анализе; определяемое вещество захватывается антителом Abl, что позволяет выделить его из остальной пробы. Захваченный антиген затем выдерживают с избытком второго, меченого антитела АЬ2, которое связывается только с уже существующими комплексами антитело-антиген (рис. 7.9-6).

Меченое антитело Аb2 должно быть способно специфически соединяться с поверхностью связанного антигена. В идеальном случае сандвичевого анализа в отсутствие меченого антитела нет никакого сигнала. На практике всегда есть некоторый сигнал, возникающий за счет неспецифического связывания Аb2 с Аb1, так что даже в отсутствие общего сигнала:

(7.9-12)

где 50бщ — сигнал, возникающий за счет

В присутствии слоя Аb1 связывание Ag описывается константой KpaBai в соответствии с уравнениями 7.9-1-7.9-6 (где Аb1 = АЬ и КрАВ„1 = Кравя), но затем его контролируют с помощью присоединения АЬ2 к связанному антигену Agb, описываемого константой -Кравн 2'-

(7.9-13)

Контролируемый сигнал для связанного (АЬ2ь) и свободного (АЬ2/) меченого антитела должен различаться. Обычно измеряют связанное антитело, так что уравнение 7.9-13 означает, что будет полезлым использовать избыток АЬ2, при котором соблюдаются условия

(7.9-14) и уравнение 7.9-13 преобразуется в

(7.9-15)

Однако существует оптимальная концентрация меченого антитела. Более

высокие концентрации увеличивают неспецифическое связывание с захвачен- а к ч

Рис. 7.9-6. Иммунометрическое . (санд-вичевое) определение антигена.

Рис. 7.9-7. Разделение связанной и свободной фракций с использованием избытка антигена на твердой фазе.

С другой стороны, концентрация АЫ не влияет на чувствительность до тех пор, пока его количества хватает для захвата антигена пробы (как правило, в концентрации больше чем ~ 10~⁹ моль/л, но обычно выбирают ~ 10~⁶ моль/л, чтобы попасть в область постоянной степени связывания > 90%).

3. Варианты устройства

Общее рассмотрение

В последнем разделе были очерчены основные теоретические принципы, но можно разработать почти неограниченное число вариантов связывания активных центров последовательностей и сандвичей, которые в конечном итоге достигают одной цели, а именно оценки концентрации определяемого вещества! Общими чертами классических методов иммунного анализа является то, что они определяют содержание не напрямую, а с помощью меченого аналога определяемого вещества или меченой системы распознавания определяемого вещества. Они также требуют разделения сигналов от свободного и связанного меченого маркера; это требование является первостепенным в иммунном анализе.

Разделение связанной и свободной фракций можно провести различными способами. В жидкофазном анализе растворов используют осаждение, центрифугирование и декантацию, но они дают весьма непостоянные результаты и поэтому не нашли широкого применения. Первый большой успех в этом направлении сделали Майлс и Хейлс (1968), которые предложили удалять несвязанные меченые антитела, вводя большой избыток антигена в твердой фазе (рис. 7.9-7).

Эта разработка положила начало развитию твердофазного иммунного анализа, в котором, однако, возникают дополнительные трудности, особенно в аспекте термодинамики взаимодействий. Твердофазный анализ отличается от анализа в жидкой фазе как по реакционной способности иммобилизованного антитела или антигена, так и по различию кинетики реакций в растворе и реакций, включающих твердую фазу (см. также разд. 7.8).